WB实验中出现不同情况的条带问题怎么解决呢？

Western blot是一个非常基础的实验，但是着实让我们头疼，即使是老手也挡不住WB实验的千锤百炼，懂得都懂，当WB实验中出现不同情况的条带问题怎么解决呢？，我们一起来探讨一下，希望对正在做WB实验的小伙伴提供一个避雷参考！

情况一：条带呈笑脸状

1.迁移过快或电泳温度过高：降低电压或低温电泳。

2.配胶问题，凝胶不均匀冷却，中间冷却不好迁移过快：重新配胶，电泳槽老化换新。

情况二：条带呈皱眉状 

配胶问题，可能是装置不合适特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡或者凝胶两边聚合不wan全。

情况三：条带弥散或拖尾

1. 蛋白上样量过多：降低上样量。

2. 电泳结束后未立即转膜：电泳后尽快转膜。

3. 蛋白降解：加入蛋白酶抑制剂。

4.样品核酸污染：可进行超声及核酸酶处理或样品有不溶物，可稀释，充分裂解或离心操作。

情况四:条带偏斜

电极不平衡或者加样位置偏斜。

情况五：条带向两边扩散，不完整

1.抗体孵育不均一，或未充分结合：增加抗体孵育时间，建议4℃过夜孵育。

2.抗体浓度偏低：使用高浓度抗体。

3.化学发光液未加均一：适当增加化学发光液的量。

4.反应时间不够：增加化学发光显色反应的时间。

情况六：条带空心

可能由于蛋白浓度过高导致的底物消耗完毕，建议稀释样本浓度。

情况七：条带有不均匀的污点

1.膜上有气泡：转膜时将PVDF膜慢慢贴胶上后，可以用玻璃棒轻轻滚动，以驱赶膜与浇之间的气泡。

2.设备污染：确保设备清洗干净。

3.孵育或洗涤溶液不足，确保孵育洗涤充分。

4.封闭液未混匀，确保混匀，使用新鲜的封闭液，避免颗粒不溶物。

5.膜被污染：实验操作人员戴手套和口罩，穿实验服，保持膜的干净。禁止用手直接触摸膜。

情况八：深背景出现白色反光条带

中心部位高浓度 HRP 将底物消耗过快，中间部位底物消耗完后无法发光。

1.蛋白上样量过多：降低蛋白上样量。

2.一抗二抗浓度过高：适当加大抗体稀释。

情况九：哑铃型条带

1. 配胶问题，可能拔胶时用力过猛，导致胶变形突起：重新配胶。

2. 蛋白质有杂质。

情况十：出现非均一性背景，脏乱

膜可能曾经干过：可在实验过程中要保证膜一直处于湿润状态。

以上就是有关于WB实验中出现不同情况的条带问题怎么解决的问题解答，如果您有更多关于WB实验条带问题想咨询请给上海金畔留言，我们会第一时间给您回复！

WB实验常见问题有哪些？如何解决？

Western Blot虽是实验室zui常用的蛋白分析技术，但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多，所以导致在实验过程中会遇到各式各样的问题，那么你知道WB实验常见问题有哪些呢？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、目标条带没有信号

原因分析：

1.样品中可能含有蛋白酶，使蛋白样品分解成小分子。

2.目标蛋白浓度过低（低于检测下线）。

3.转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿。

4.一抗的特异性不佳，导致一抗无法识别目标蛋白。

解决方法：

1.添加蛋白酶抑制剂。

2.加大上样量或提高目标蛋白浓度。

3.控制转膜时间并选择适合的转印膜。

4.选用高品质抗体。

二、图片背景过高，难以分辨条带

原因分析：

1.一抗浓度太高，导致抗体非特异性结合。

2.洗膜的时间和次数不够，导致其他蛋白没有清洗干净

3.封闭物用量不足。

4.封闭物使用不当。

解决方法：

1.降低一抗浓度。

2.提高洗脱时间和频率。

3.提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液wan全浸没转印膜。

4.检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。

三、 膜上出现黑点和黑斑

原因分析：

1.抗体与封闭试剂反应。

2.HRP偶联二 抗中有聚集体。

解决方法：

1.使用前过滤封闭试剂。

2.过滤二抗试剂，去除聚集体。

四、出现非特异性条带

原因分析：

1.一抗非特异性与蛋白结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。

2.目的蛋白有多个修饰位点，有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。

3.蛋白样品降解，蛋白酶将目标蛋白分解成若千个蛋白，而这些蛋白同样可以被一抗识别。

解决方法：

1.更换一抗。

2.更换一抗品种。

3.添加蛋白酶抑制剂。

五、条带粘连

条带粘连是不同孔目标条带连在一起，中间无间隔，如图所示。出现该现象的原因可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）

更多有关WB实验常见问题及解决方法，请联系上海金畔生物科技有限公司：

你知道WB实验操作步骤有哪几步吗？

蛋白质印迹(Western blotting)：又称为免疫印迹，根据抗原抗体的特异性结合，半定量检测样品中的某种蛋白的方法。基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析条带的位置和条带深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况。那么你知道WB实验操作步骤有哪几步吗？让我们一起来看看吧！

一、样本制备蛋白提取

1.前期准备：首先要了解你所研究蛋白的内源表达水平，常用的数据库如Uniport、Atlas、BioGPS，或查阅相关文献。设置阳性对照，选择内参蛋白。

2.蛋白提取：是Western Blotting 的第一步，要求选择样本新鲜，降低背景，避免反复冻融，选择合适的裂解液裂解样本，选择合适的蛋白酶或磷酸酶抑制剂，防止蛋白的降解和磷酸化信号的丢失。

二、蛋白浓度测定

蛋白质浓度测定的方法包括Lowry法、Bradford法、BCA法，常用的是BCA法，基本原理是在碱性条件下，蛋白将Cu+ +还原为Cu+，Cu+ 与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

之后加入Loading buffer，含有变性剂，使蛋白质变性，释放二硫键，最后煮沸变性保存样品于-20℃或-80℃。

三、上样和电泳

1. 制备凝胶：根据蛋白分子量的大小，选择合适浓度的分离胶，配胶的APS需要在4℃的冰箱中保存。配胶的试剂中，APS与TEMED是促凝剂，所以在加促凝剂之前，需先把其他组分混匀。

2.上样：蛋白Marker孔加入5-10μL，多选择生物素化蛋白Marker，其余蛋白总上样量20-50μg，组织样本稍多些上样，尽量保持每个泳道的上样量一致，空泳道用Loading buffer补齐。

3. 电泳：接上电源后，先用80V恒压电泳浓缩至溴酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处，成线状，改为恒压100v–120v直至溴酚蓝电泳到凝胶底部，此过程约用时1.5h。

四、转膜

1.膜的选择：广泛使用的是NC膜和PVDF膜

2.转膜：转膜的方法包括湿转、半干转、干转，湿转是转膜最完quan且应用zui广泛的方法，但是所需时间较长。

五、封闭和抗体孵育

1.封闭：目的是为了减少膜对一二抗的非特异吸附，降低背景。将NC膜从湿转系统中取出，并用TBST润洗2次，每次5 min，然后进行封闭。

化学发光法：用含5% 脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡NC膜，室温摇床封闭1-2h；

荧光法：含5% 脱脂奶粉的TBS，脱脂奶粉需选择实验室级别的。

最后再用TBST润洗封闭后的NC膜3次，每次5 min。

2.抗体孵育：一抗能识别膜上不同种属的蛋白，买经过验证的，二抗上带有发光底物，只能识别一抗。

六、显色曝光

常用的是化学发光，抗体上偶联的HRP催化ECL发光底物显色，取出洗涤的膜后，用滤纸吸干水分，放置于成像仪上，均匀滴加ECL工作液，排出气泡，开始曝光。

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