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Dualucif^® Firefly & Renilla Assay Kit（双萤光素酶报告基因检测试剂盒）

产品货号: F6075S/F6075M/F6075L

产品规格: 20T/100T/1000T

目录价（元）:286/1105/6189

推荐仪器：化学发光仪、酶标仪或液闪测定仪

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产品概述：

储存条件

-80℃保存，有效期见外包装。C组分建议预先使用无菌水配置为2 mg/mL储液，B组分、D组分及配置为储液的C组分，根据实验需求进行小批量分装。所有检测工作液建议现配现用，避免反复冻融。

产品介绍

Dualucif^® Firefly & Renilla Assay Kit（双萤光素酶报告基因检测试剂盒）为检测基因的表达量提供有效的手段，在 DLR检测中，萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）和海肾萤光素酶（Renilla luciferase）的活性可在单个样品中依次检测。先以萤光素（Luciferin）为底物来检测萤火虫萤光素酶的活性，然后加入抑制萤火虫萤光素酶催化的物质，同时加入腔肠素（Coelenterazine）检测海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。通过萤光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5′ 启动子区克隆在Luciferase的上游，或把3′-UTR 区克隆在Luciferase的下游，构建成报告基因（Reporter gene）质粒，然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，通过检测萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。海肾萤光素酶更多地被用作检测转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61 kD 的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化萤光素生成氧化萤光素（Oxyluciferin），在萤光素被氧化的过程中，会产生光信号。海肾萤光素酶是一种分子量约为36 kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素氧化成肠酰胺（Coelenteramide），在腔肠素氧化的过程中也会产生光信号。本试剂盒的光信号可以通过化学发光仪、酶标仪或液闪测定仪进行测定。该试剂盒具有检测迅速、灵敏度高、检测范围广，无细胞内源活性干扰等特点。

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。

3. 萤火虫萤光素酶催化的生物发光的最强波长为560 nm，海肾萤光素酶催化的生物发光的最强波长为480 nm。

4. 为防止孔间干扰，建议使用白色不透光孔板。

5. 由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

说明书：

 UE-F6075S/F6075M/F6075L    
MSDS：
MSDS F6075 Dual Luciferase Assay Kit
常见问题解答：

◆双萤光素酶报告基因最适反应温度？

室温（20-22℃）。反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。此两种萤光素酶的反应速率是受温度影响的，为了保证实验的一致性，我们推荐此两种工作液在检测时都孵育至室温。

◆双萤光素酶报告基因载体该如何选择？
（1）萤火虫报告基因质粒原则上含有luc基因就可以，但是不同实验所需的载体有一定差异，如果您要自己构建载体，要注意有些载体没有启动子，需要自行插入启动子，如pGL3 Basic。
（2）海肾报告基因质粒尽量选择中等强度的启动子，如TK启动子等，不要选择强启动子CMV、SV40等。海肾基因的表达活性应显著高于背景组，同时不干扰萤火虫萤光素酶报告基因的表达。。

◆检测的萤光数值很低怎么办？
（1）可能为转染效率低
a.优化转染实验条件，用较易转染的质粒做阳性对照（如转染过表达荧光蛋白质粒）；
b.确保转染DNA的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定；
c.选择活性较高，处于指数分裂期的细胞进行转染。
（2）可能为启动子活性低或诱导失败
a.转染后的细胞培养使用特异性诱导启动子的条件；
b.优化细胞的培养条件，提高萤光素酶的表达量；
c.更换强启动子（如SV40、CMV）。
注：海肾萤光素酶基因作为内对照，其表达应不受时期、部位、环境影响，因此常用组成型表达的TK启动子。
（3）样品裂解效率低
a.细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好，长时间培养后，细胞可能会难裂解。
b.加入的裂解液需足量，保证细胞能够充分裂解。
（4）检测过程操作不规范
a.选择合适的检测仪器，能够检测化学发光或者生物发光的仪器都适用于该实验；
b.需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差；
c.室温反应。反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温；
d.萤光素酶的半衰期一般约30min，加完底物后可立即检测，尽量在30min内完成。
（5）底物氧化失效
a.底物避光密封保存，萤火虫萤光素酶底物-20℃保存；海肾萤光素酶底物推荐-80℃保存；
b.反应工作液建议现用现配。

使用本产品的文献：

参考文献
1.DDX3 Activates CBC-eIF3-Mediated Translation of uORF-Containing Oncogenic mRNAs to Promote Metastasis in HNSCC.
应用方向：基因转录调控检测

2.Glucose starvation induces LKB1-AMPK-mediated MMP-9 expression in cancer cells.
应用方向：基因转录调控检测

3.Repression of MAP3K1 expression and JNK activity by canonical Wnt signaling.
应用方向：基因转录调控检测

4.The cellular stress proteins CHCHD10 and MNRR1 (CHCHD2): Partners in mitochondrial and nuclear function and dysfunction.
应用方向：基因转录调控检测

5.Large-Scale Screening of Natural Products Transactivating Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α Identifies 9S-Hydroxy-10E,12Z,15Z-Octadecatrienoic Acid and Cymarin as Potential Compounds Capable of Increasing Apolipoprotein A-I Transcription in Human Liver Cells.
应用方向：基因转录调控检测