l 是切刻内切酶
l WarmStart 技术可在低于40°C 条件下抑制酶活性
l 产生切刻的 DNA 分子，而不是切断的 DNA 分子
l 可在室温条件下建立反应，在链置换扩增（SDA）反应中表现极佳
l 限制性内切酶酶切位点：GAGTC(4/-5)
WarmStart Nt.BstNBI，克隆自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus Stereothermophilus），是一种位点特异性切刻内切酶。配方中加入了能够可逆结合的适配体，在低于 40℃ 条件下抑制酶的切刻活性。WarmStart Nt.BstNBI 仅切割双链 DNA 底物上的一条链，在识别序列后第 4 个碱基的 3´ 端产生单链切刻。
重要说明
Nt.BstNBI催化在识别序列的 3′端产生一个单链切刻。WarmStart 功能实现是通过在配方中加入 DNA 适配体，在低于 40°C 条件下抑制酶活性。
图 1：WarmStart Nt.BstNBI 在 25 °C条件下检测不到活性
A) 对噬菌体 T7 DNA 的切刻活性。1 μg T7 噬菌体 DNA 与不同量的 WarmStart Nt.BstNBI（NEB #R0725）和 Nt.BstNBI（非 WarmStart, NEB #R0607）在 50 μl 的 含 NEBuffer r3.1 的反应体系中，于 25°C 或 55°C 条件下孵育 1 小时。加入 8 units 的酶并进行 2 倍的系列梯度稀释。如“+”所表示，当温度设置在55°C 时，两种酶都显示完全活性；当温度限制在 25°C 时，WarmStart 版本酶无活性。
B) 对荧光标记的双链 DNA的切刻活性。将 2 pmol 含有 Nt.BstNBI 识别位点的 48 bp 长的双链 DNA 与不同量的 WarmStart Nt.BstNBI（NEB #R0725）和 Nt.BstNBI（非 WarmStart, NEB #R0607）在 20 μl 含 NEBuffer r3.1 的反应体系中，分别于 25°C 或 55°C 条件下孵育 30 分钟。加入 10 units 的酶并进行 2 倍的系列梯度稀释。将反应在 20 mM EDTA、0.1% Tween 20 中淬灭，然后用水稀释至 FAM 标记的双链 DNA的终浓度为 1 nM。在Applied Biosystems 3730xl Genetic Analyzer (96 capillary array) 上通过毛细管电泳（CE）进行片段分析，产物百分比（% Product）代表产物峰面积除以 FAM 通道中所有峰的总面积。以产物百分比（% Product）为 Y 轴，切刻酶单位数的对数值为 X 轴作图，其中产物百分比（% Product）的平均值和标准差取自三次重复实验。
结论：WarmStart 版本在 55°C 条件下与常规版本活性相当，而在 25°C 条件下未检测到活性
图 2： WarmStart Nt.BstNBI 的反应温度曲线
在不同温度（25°C 至 80°C，间隔 5°C）下检测 WarmStart Nt.BstNBI (NEB #R0725) 和 Nt.BstNBI (Non-WarmStart NEB #R0607) 对荧光标记的双链 DNA的切刻活性。在 20 μl 含 NEBuffer r3.1 的反应体系中，加入 0.125 units WarmStart 或非 WarmStart 的 Nt.BstNBI 和 100 nM 的双链 DNA（5’6-FAM 标记）的反应，分别于不同温度下孵育 30 分钟。以产物百分比（% Product）为 Y 轴，反应温度为 X 轴作图，其中产物百分比（% Product）的平均值和标准差取自三次重复实验。
结论：WarmStart Nt.BstNBI 在低于 40°C 条件下只有不到 10% 的活性，在低于 30°C 条件下检测不到活性，因此可以在室温下建立反应，避免发生不希望的底物切刻。
图 3: WarmStart Nt.BstNBI 能够在室温下建立反应，因此在 SDA 中表现极佳
使用 WarmStart Nt.BstNBI (NEB #R0725) 或 Nt.BstNBI ( 非 WarmStart，NEB #R0607），在 25°C 下孵育 30 分钟后（模拟室温条件建立反应），或在冰上建立反应后立即进行相同的链置换扩增 (SDA) 反应。反应体系中加入 25 μl 1X 等温扩增缓冲液 (NEB #B0537)、0.5 μl LAMP 荧光染料 (NEB #B1700)、0.4 mM dNTP (NEB #N0447)、10 ng 模板 DNA（HeLa 基因组 DNA，290 个拷贝）、每种引物各 0.5 mM，1 μl Bst 2.0 DNA 聚合酶 (NEB #M0537S) 和 1 μl WarmStart Nt.BstNBI 或 Nt.BstNBI，在 55°C 下进行等温扩增并监测荧光 45 分钟。测试样品和阴性对照中阳性信号出现的时间差异仅在冰上建立的反应（两种版本）或室温下 WarmStart 版本的反应中是可区分的。重复实验之间的差异很小。
结论：在检测基因组 DNA 中 hBRCA1 扩增子的 SDA 反应中，只有 WarmStart Nt.BstNBI 能够成功在室温下建立反应。
