NEB Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2）是 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶的优化预混液。BsmBI-v2 是 NEB 公司研发的 BsmBI 的升级版本，在 Golden Gate 组装中的表现优于原酶。这些酶联合使用可完成多个插入片段/模块的组装，也可用于单插入片段克隆/文库构建。试剂盒提供 pGGAselect 目的质粒，作为组装骨架。该多功能目的质粒上定向克隆有 BsmBI-、BsaI- 和 BbsI- 的识别位点，使其能方便地与这三种在 Golden Gate 中最常用的 IIS 型限制性内切酶一起使用。该质粒还含有多个限制性内切酶识别位点，方便进行亚克隆，并具有 T7/SP6 启动子序列，供体外转录使用。
起源于 1996 年的 Golden Gate 组装（1，2）技术可对 DNA 片段进行高效无缝组装，该技术利用 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶的分步（3）或同步（4）作用，可将多个插入片段组装进载体骨架。
IIS 型限制性内切酶与识别位点结合，却在识别位点下游的特定位置切割 DNA，切割位点是位置特异，而非序列特异。因此，单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如，BsmBI 的识别位点为 CGTCTC(N1/N5)，其中 CGTCTC 是识别和结合位点，而 N1/N5 表示切割位点位于正义链的第一个碱基后，反义链的第五个碱基后。酶切片段间产生 4 个碱基的互补突出末端，发生退火进行连接。酶切后的片段及最终的组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点，所以不可能进一步发生酶切。组装产物随时间逐渐增多。
该方法特别适用于多片段组装，例如 TALEs （Transcription Activator Like Effectors，转录激活因子样效应物）（5）和 TALENs（TALEs 与 FokI 核酸酶催化结构域融合表达）（6）。Golden Gate 方法也适用于单片段克隆、构建不同来源的文库克隆来自不同来源的片段和涉及定向进化的多位点突变研究（7）。
请注意，虽然 Golden Gate 组装中常用到 BsmBI 内切酶，但 NEB 的试剂盒和操作步骤中则使用 BsmBI-v2，该酶是原酶经过改造和优化的升级版。
观看视频教程，以了解更多 Golden Gate 组装的工作流程。
图 1. 概述：使用 BsmBI-v2 进行 Golden Gate 组装操作
图 2. Golden Gate 工作流程
简单来讲，Golden Gate 组装需要 IIS 内切酶的识别位点，在本示例中，需要在 dsDNA 片段的两端加上其识别位点（CGTCTC）。酶切后，识别位点被切除，组装片段末端带有设计好的特定 4 碱基突出以指导组装。
图3. 用 BsmBI-v2 进行高效和高保真 Golden Gate 组装
遵循 11-20+ 片段组装的推荐循环步骤，在含有 LacI/LacZ 的表达框中组装 24 个片段。虽然 30 个循环足以完成复杂组装，但 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶的稳定性允许连续进行 65 个循环的组装且背景低。（a）组装效率和（b）组装准确性（保真度）与循环数的关系如图所示。
图4. 用 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶进行复杂组装
遵循 11-20+ 片段组装的推荐循环步骤，在含有 LacI/LacZ 的表达框中组装 24 个片段，但延长循环数增加到 65 个循环。从 25 µl 组装反应中取 2 µl 进行转化和增菌培养后，取 1/10 体积的增菌培养物接种平板，1100 个菌落生长，菌落的保真度高达 96%，相当于每次组装反应产生 137,500 个菌落。该实验证明了酶混合液的稳定性，如果预期获得最大组装效率，循环数量可以超过标准的 30 个循环。
NEB Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2）包含：
– NEB® Golden Gate 酶预混液
– T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X）
– pGGAselectII DNA
用于 Golden Gate 的 IIS 型限制性内切酶
– BsaI (NEB #R0535)
– BsaI-HFv2 (NEB #R3733)
– BbsI (NEB #R0539)
– BbsI-HF (NEB #R3539)
– BsmBI (NEB #R0580)
– BsmBI-v2 (NEB #R0739)
– Esp3I (NEB #R0734)
NEB Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2）包含：
– NEB® Golden Gate 酶预混液
– T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X）
– pGGAselectII DNA
用于 Golden Gate 的 IIS 型限制性内切酶
– BsaI (NEB #R0535)
– BsaI-HFv2 (NEB #R3733)
– BbsI (NEB #R0539)
– BbsI-HF (NEB #R3539)
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– BsmBI-v2 (NEB #R0739)
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1. Engler, C. et al.(2008).PLoS ONE. 3, e3647.
2. Engler, C. et al.(2009).PLoS ONE. 4, e5553.
3. Lee, J.H. et al.(1996).Genetic Analysis: Biomolecular Engineering.13, 139–145.
4. Padgett, K.A. and Sorge, J.A.(1996).Gene.168,31–35.
5. Weber, E. et al.(2011).PLoS ONE.6,e19722.
6. Christian, M. et al.(2010).Genetics.186,757–761.
7. Pullman, P. et al.(2019).Nature.9,10932.
8. Potapov, V. et al.(2018).ACS Synth. Biol. 7, 2665–2674.
