NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）

NEB 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级）

Q5 热启动超保真 2 X 预混液

Ÿ   使用新酶 BsaI-HFv2（针对 Golden Gate 应用优化）

Ÿ   无缝克隆 – 组装后无额外碱基存在

Ÿ   目的质粒含 T7/SP6 启动子

Ÿ   单次反应即可按顺序组装多个片段（2-20+）

Ÿ   也可用于单个片段克隆和文库制备

Ÿ   有效组装高 GC 区和重复区

Ÿ   兼容片段长度广（＜100 bp 至 ＞15kb

 – BsaI (NEB #R0535)

– BsaI-HFv2 (NEB #R3733)

– BbsI (NEB #R0539)

– BbsI-HF (NEB #R3539)

– BsmBI (NEB #R0580)

– Esp3I (NEB #R0734)

 NEB Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HFv2）内含优化的混合液。利用 Golden Gate 方法，混合液中的 BsaI-HFv2 和 T4 DNA 连接酶可以完成多个片段的组装。试剂盒自带目的质粒 pGGA，为组装提供骨架，同时为亚克隆提供限制性内切酶酶切位点，以及为体外转录提供 T7/SP6 启动子序列。

Golden Gate 可高效、无痕地克隆组装 DNA片段。该方法起始于 1996 年，当时是第一次使用 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶依次或同时将多个目的基因插入到同一个载体骨架上。

IIS 型限制性内切酶结合于识别位点，却在识别位点的下游特定位置进行切割，切割位点是位置特异的，而非序列特异的。这样，单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如，BsaI 的识别位点为 GGTCTC（N1/N5），其中 GGTCTC 是识别和结合位点，而 N1/N5 表示切割位点位于上链的第一个碱基后，下链的第五个碱基后。片段连接是通过酶切产生的 4 个碱基突出端互补而形成。酶切后的片段及最终组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点，所以不可能进一步发生酶切。组装产物随时间逐渐积累。

该方法特别适用于多重组装实验，例如 TALEs （转录激活因子样效应物）和 TALENs（TALES 与 FokI 核酸酶催化结构域融合表达）。Golden Gate 方法也适用于单一目的基因的克隆实验以及不同来源基因的文库构建。

连接酶保真度的研究进展：NEB 的不断研究加深了我们对连接酶保真性的认识，包括评价末端连接保真度的多种手段的开发，从而更好地预测何种突出末端具有更高连接保真度。该研究使突出末端的选择更为慎重，这对于构建复杂 Golden Gate 组装产物尤为重要。更多详情请联系我们。 www.neb.com/goldengate

为加快实验进程，请联系我们。 GoldenGate.neb.com 使用设计软件。

Ligase Fidelity Viewer*

使 Golden Gate 突出末端连接组装设计变得可视化。*这是一个 NEBeta™ 软件，在设计和使用上还不够完善。欢迎分享您的使用反馈。使用该软件请联系我们。 www.neb.com/research/nebeta-tools。