细节决定western blot的结果

细节决定western blot的结果

细节决定成败，western blot更是如此，那让我一一为大家介绍这些细节的地方吧。 

一、 样品准备部分

有好的开始，才会有好的结果。良好的样品的制备，是WB的重中之重，特别是以下几个方面：

1. 时间把控到位

尽管样品的处理浓度可能不同，处理时间也可能不同，无论是孵育的时间还是终止的时间，都要按照预先设计的时间来进行，提前或者推迟，都会影响最终的结果。

2. 防止蛋白降解

防止蛋白降解的方法通常有两种：

（1）低温操作

所有的用具、样品、裂解液等都提前预冷，实验全程在低温（4℃）下操作，可以有效防止蛋白讲解

（2）蛋白酶抑制剂

将蛋白酶抑制剂和PMSF共同使用，能有效防止蛋白降解。

3. 裂解液用量把控精确

裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。若裂解液量较少，就会导致蛋白浓度太高，与上样缓冲液反应不充分，电泳后会出现多条条带，条带形状也不好；若裂解液量过多，蛋白浓度被稀释，会导致在胶孔中的上样量不足，条带不清晰。

二、 WB 电泳部分

有了好的开端，再加上好的过程，势必会有好的结果。WB过程中需要注意的细节如下：

1. 制胶

Biorad的制胶试剂盒，让制胶的日子洒满了阳光。

2. 上样

实验不同，上样的总蛋白量稍有不同。若上样体积小的，可用枪头直接上样；若上样体积>20ul，建议采用微量注射器；若上样体积太大，可采取间断上样。

3. 电泳

样品到达分离胶之前，控制电压≤60V，能有效解决样品排列不整齐的问题。样品到达分离胶之后，可调节电压为100V，若时间充足，维持电压在60V以下，效果更好。

4. 转膜

电泳开始后就配置电转液，加入甲醇，预冷。预冷是神助。

我们的实验，有了上述的神助攻的细节，期待你的结果吧。

Western Blot （蛋白印迹）

Western Blot （蛋白印迹）
Western Blot（蛋白印迹）简介
       Western blot，也称Western、Western blotting、Western印迹、蛋白免疫印迹，是检测目的蛋白常用而且重要的方法之一。基本原理是通过将电泳分离后的细胞或组织总蛋白从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原，后通过分析底物化学发光（ECL）显色底片上曝光的位置和深度获得特定蛋白在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
       Western Blot是的一种常用的蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面，具有高分辨率和固相免疫测定的高特异性和敏感性，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。  
 
 
 
试验流程
1、细胞蛋白提取和定量。
2、10-15%的SDS-PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3、蛋白转膜（PVDF膜）。
4、蛋白封闭 （5%脱脂奶粉）。
5、一抗孵育。
6、二抗孵育。
7、暗室显色（ECL），洗片等。
8、数据分析。
 
实验结果示例

 
客户提供
1、实验信息，包括抗体类型，蛋白分子质量和性质等。如果需要培养细胞，并进行药物处理，需要提供细胞类型和化合物。
2、实验结果要求等。 
 
我们的优势
1、多种抗体供实验需要。
2、专业的操作人员。
3、高规格实验室。
4、数据结果交付周期快。
  
服务流程
1、提交项目课题相关需求和资料。
2、与我们的专业技术团队讨论项目细节。
3、根据讨论后的意见对实验方案进行修改。
4、双方均满意并达成一致，签订技术服务合同。
5、开展实验，按期完成合同规定的内容。
6、结题，提供实验原始结果和分析结果、实验流程、实验条件等等。
 
咨询与订购
感谢您选择我们的服务，如果您有任何问题，请联系我们，我们将竭诚为您解答和服务。
 

Western Blot 小视频，熟手精进，新手改进！

1、如何征服蛋白质免疫印迹Western Blot-熟手来精进，新手来改进！

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2、蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验疑难解答

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3、Western Blot-电泳实验指导-Electrophoresis

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4、Western Blot-半干转实验指导-Semi-Dry transfer

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5、Western Blot-样本前处理-Sample preparation

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6、如何快速消除胶上的小泡泡

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7、「胶」你怎么做！Western blot省时小密技

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8、研究生必看-如何挑选抗体?

Western-blot 实验原理、实验步骤及试剂选择指南

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的常用的方法之一。本文分别介绍western 的实验原理、实验步骤以及试剂选择指南。  

实验原理：

Western技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤：

1.收集蛋白样品

用适当的裂解液处理贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。某些特定组分的蛋白的蛋白抽提，请欣博盛为您查询。  

收集完蛋白样本后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。 

2. 电泳

2.1 SDS-PAGE凝胶配置

2.2 样本处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

2.3 上样与电泳

冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3. 封闭

转膜完毕后，立即将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗掉膜上的转膜液。吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，4℃封闭过夜。

4. 一抗孵育

吸尽封闭液，加入稀释好的一抗，室温摇床上孵育1小时或者4℃孵育过夜。Western结果通常需要提供内参作为对照。通常选用Tubulin或Actin抗体，进行内参检测。

一抗欣博盛推荐Genetex抗体，GeneTex抗体所含盖的领域从神经学、血液血管学、免疫学、代谢机制、细胞信号传导、干细胞研究、老化、遗传学、感染疾病诊断与研究，乃于斑马鱼模式动物抗体等，并提供完善的客制化抗体制备服务。目前该公司拥有的抗体总数已逾55,000种，而且每月仍有近百种新型抗体推出。其中，以小鼠单株抗体与兔多株抗体为该公司质量与价格优势的产品。链接如下：www.genetex。。ｃｏｍ。有详细的各个领域的研究资料。

如需订购请Genetex代理欣博盛。 

5. 二抗孵育

吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或者4℃摇床上孵育1小时。SouthernBiotech能够提供多种不同标记的二抗。 

6. 蛋白检测

6.1 ECL化学发光，显影，定影

将A和B两种试剂在离心管中等体积混匀；1 min后，将溶液平铺在膜蛋白面，暗室反应2min后去尽残液，包好，放入X-光片夹中。在暗室中显影定影。

6.2 凝胶图像分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目的条带和内参条带的净光密度值以及他们的比值。