首先介绍一下染色原理：
细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液进行媒染，之后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌媒染后的颜色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌(G+),后者为革兰氏阴性菌(G-)。为方便进一步观察，脱色后可再用一种红色染料如碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被重新染上红色。有芽孢的杆菌和大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应;弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现负反应。
细菌细胞通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
其次介绍染色步骤：
1.涂片固定。
在干净的载玻片中央滴加一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成菌悬液并涂布成直径约1cm的薄层。为避免因菌数过多聚集成团，不利于观察细菌个体形态，可在载玻片一侧进行上述操作，而在另一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可，如菌液浓度较大，也可使用水滴再进行一次稀释。
涂片需要在室温条件下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯火焰上方较高的位置微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：(1)杀死微生物，固定细胞结构。(2)保证菌体能更牢固的粘附在载玻片上，防止标本水洗时被水冲洗掉。(3)改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。
固定常常利用高温，手执载玻片的一端(涂有标本的远端),标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次，共约2s-3s,并不时以载玻片背面加热，载玻片背面触皮肤，以不觉过烫为宜(不超过60℃),待放置冷后，再进行染色。
2.染色。
在固定过的涂片菌膜上滴加草酸铵结晶紫染液，染色液应完全覆盖整个菌膜，染色1min。
3.水洗。
染色到一定的时间，拿住玻片使之成450角，用细小的水流把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。
4.媒染。
加碘液覆盖涂面染1 min。在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性的化合物，可增加染料和细菌的亲和力。
5.水洗。
用细小的水流缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。
6.脱色。
加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20s-30 s后再进行水洗，吸去水分。
7.复染。
蕃红染色液染色10 s后， 自来水冲洗。
8.干燥。
染色结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。
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