蛋白酶 WSS1A/核酸内切酶MUS81和磷酸二酯酶TDP1的特异性修复蛋白酶能酶解部分交联的蛋白质

DNA经常暴露于各种破坏性环境中，这对于保证基因组完整性是个巨大的挑战。长期的DNA-蛋白质交联（DNA-protein crosslink, DPC）是DNA分子的一种严重损伤，会导致复制叉停滞，抑制复制，正常细胞分裂被阻断，导致细胞死亡。

 

DPC可细分为酶促和非酶促两种类型。外源性和内源性原因都可能引起这两种类型的DPC。酶促反应DPC产生的中间体可以是自发的抑或是由酶毒剂例如喜树碱（camptothecin, CPT）所造成。CPT能够稳定拓扑异构酶I（topoisomerase I, TopI）与DNA的结合，使断裂的DNA链不能重新接合，DNA双螺旋从扭转张力中松弛，从而选择性抑制拓扑异构酶I的活性，阻止DNA复制及RNA合成。

因此，这些酶促反应中间体也被称为稳定的拓扑异构酶I剪切复合物（topoisomerase I cleavage complexes, TOPIcc）。非酶促 DPC 由内源产生活性醛（如代谢过程中产生的乙醛或组蛋白去甲基化过程中形成的甲醛）造成，或通过电离辐射、紫外线辐射、化学交联剂（顺铂）诱导产生。尽管DPC阻断DNA复制，对基因组完整性造成严重威胁；然而，直到较近才在人类和酵母中发现了DPC修复的主要机制。

 

报道了蛋白酶 WSS1A，核酸内切酶MUS81和磷酸二酯酶 TDP1 参与植物 DPC 修复的独立途径的相关研究工作。

前人的研究工作发现 Wss1（酵母金属蛋白酶，与SUMO途径相关）是参与 DPC 修复的关键蛋白。缺失 Wss1 的细胞对甲醛尤其敏感。哺乳动物蛋白SPRTN（又称DVC1）含有与 Wss1 相同锌金属蛋白酶结构域，被认为与 Wss1 同属于修复蛋白酶家族。在人、小鼠、哺乳动物细胞系中 SPRTN 缺失或多或少造成基因组不稳定，人类基因组中若含有 SPRTN 突变则会造成一种名为 “Ruijs-Aalfs syndrome” 的遗传疾病，引发提前衰老及癌症，表明 SPRTN 对于 DPC 修复是必需的。

 

除了 Wss1/SPRTN 组成的特异性修复蛋白酶能酶解部分交联的蛋白质，其他酶活性蛋白也能修复特异 DNA-蛋白质加合物。如酪氨酰-DNA 磷酸二酯酶I（Tyrosyl-DNA phosphodiesterase I, TDPI）直接水解酪氨酰-DNA 磷酸二酯键。该酶能特异性水解 DNA 3'磷酸和拓扑异构酶I酪氨酰活性残基，属于磷脂酶D超家族。缺失wss1/ tdp1 的酵母菌株对 CPT 尤其敏感。

 

除了修复蛋白酶的酶解作用和交联水解之外，DPC修复还可通过DNA核酸内切酶作用加工。MUS81（MMS AND UV SENSITIVE PROTEIN 81）基因先在酵母菌中被发现，由于甲基磺酸甲酯（methyl methhaiesulfonate, MMS）和UV射线导致DNA损伤而诱导该基因表达而被人们所认识，MUS81复合物构成一个结构特殊的核酸内切酶，能够剪切分叉DNA结构，特别是停滞的复制叉，是帮助同源重组中间体比如Holliday junction（霍利迪连结体，一种减数分裂和同源DNA 修复中形成的四链DNA中间体）正常解聚所必须的蛋白，在DNA重组修复中起极重要的作用。遗传学分析说明，MUS81在紫外线损伤的抗性途径中发挥作用，表现出对非酶促DPC诱导剂的敏感性 。

 

系统学分析表明，植物具有两种Wss1的直系同源基因（orthologue），WSS1A 和 WSS1B，两者都在N末端有类泛素化（UBL）结构域，在系统树上皆属于UBL-Wss1分支【4】。本文不仅鉴定了 WSS1A 和 WSS1B 在拟南芥 DPC 修复中的作用，而且还分析了它们与 TDP1 和 MUS81 相关的作用，表明植物确实具有三种不同的 DPC 修复途径。

 

先，研究者通过 CRISPR/Cas 系统构建了拟南芥 WSS1A 和 WSS1B 缺失功能突变体。通过对突变体的遗传实验分析和 DPC 诱导剂实验分析，发现只有 wss1A 突变体表现出了生长缺陷。DPC 诱导剂 CPT 的处理实验也表明，只有 wss1A 突变体对 CPT 敏感，进一步的实验则构建了 wss1A wss1B 双突变体，发现其表型与 wss1A 单突并无差异，说明只有 WSS1A 对于拟南芥中的 DPC 修复是必需的。

 

研究人员进一步探索了 TDP 与同源重组所引发的DPC的修复作用。研究者使用三种 tdp1 突变株系，tdp1-2（SALK119060），T-DNA 插入在8号外显子中，除了 T-DNA 突变体系外，还使用了两个 CRISPR/Cas9 技术构建的突变株系 tdp1-3 和 tdp1-4【5】。发现这三个突变体表型与野生型无异，对CPT的敏感性也与野生型无异。有趣的是，tdp1 单突变体 CPT 不敏感， wss1A tdp1 双突变体显示出比 wss1A 单突变体更高的灵敏度，说明 TDP1 与 WSS1 所在的 DPC 修复途径是互相独立的，WSS1 所参与的是一个起了主要作用的修复通路，而 TDP1 所在的修复通路可能是一个次要的备用路径。

 

通过构建 wss1A mus81 和 tdp1 mus81 双突变体对比各自的单突变体和野生型，发现mus81-1 单突变体与野生型生长状况并无区别，而wss1A mus8-1 则表现出了比 wss1A 更强烈的突变表型。有趣的是，CPT 处理后, mus81 表现出了比 wss1A 更强烈的表型，双突变体则呈现了强烈的叠加效应。还检测了 tdp1-4 mus81-1 对CPT处理的表型差异，发现从植物整体上看，tdp1-4  与野生型并无差异，tdp1-4 mus81-1 双突变与 mus81-1 类似，但是如果从根分生组织中死细胞增加的水平上看（该表型比植株整体表型对诱导剂处理更敏感），两者还是存在了细微的差别，tdp1-4 mus81-1 双突变比 mus81-1 死细胞数增多，更为敏感，这说明MUS81 和 TDP1 在 DPC 修复中叶处于平行的通路，且 MUS81 的作用更为主要。

 

通过植株正常表型以及在 CPT 处理后表现出生长缺陷和根分生组织中死细胞增加的事实表明在拟南芥中存在三种独立的DPC修复途径，DNA 核酸内切酶 MUS81 和蛋白酶 WSS1A 为主要参与者，磷酸二酯酶 TDP1 作为备用。

金畔生物供应蛋白交联剂产品：

碳化二亚胺(EDAC)交联剂

己二酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS—AA)

血红蛋白交联剂双-(3,5-二溴水杨酸)丁二酸酯

鸡毛蛋白助剂交联改性羊毛条

阳离子交联剂WLS

大豆蛋白粘合剂的交联剂

异型双功能交联剂m-MBS

EGDE交联血红蛋白

蛋白质交联剂戊二醛

蛋白质交联剂甲醛

多元羧酸交联剂

DNA-蛋白质交联

蛋白质纤维的交联

聚丙烯酰胺(PAM)交联剂

戊二醛聚合猪血红蛋白

巯基交联剂聚合牛血红蛋白

二甲基己二亚胺酸酷(DMA)交联剂

聚乙二醇介导RNase-BSA偶联物

NHS交联剂偶联量子点

NHS交联剂偶联氨基

量子点–生物蛋白偶联物

多柔比星免疫偶联物

RGD肽与力达霉素辅基蛋白偶联物

天花粉蛋白偶联物

TAT-EGFP(穿膜肽–增强型绿色荧光蛋白)

抗体(抗HBsAg-IgG)-蛋白微球(BSA-NS)

三联偶联物(TAT-EGFP-IgG-BSA-NS)

阿霉素偶联膜联蛋白V

N-唬拍酞胺-3-(2-毗吮二硫)-丙酸醋(SPDP)

巯基交联剂聚合牛血红蛋白

京尼平交联乳清蛋白和壳聚糖膜

三聚磷酸钠(TPP)交联剂

糖类交联明胶微球

辛二酸二琥珀酰亚胺酯交联血红蛋白

环氧树脂交联水解胶原蛋白

碘胺嘧啶银胶原蛋白烧伤膜

豆粉改性小桐子蛋白基胶粘剂

核壳结构的蛋白质—多糖纳米凝胶

EDC交联血红蛋白

磺胺嘧啶银(SD-Ag)胶原蛋白烧伤膜

壳聚糖微球固定木瓜蛋白酶

吲哚美辛胶原蛋白烧伤膜

交联剂环氧氯丙烷

交联壳聚糖–季铵化水解胶原蛋白

细菌纤维素/聚乙烯醇/胶原蛋白复合膜

缩水甘油醚交联改性胶原蛋白施胶剂

吲哚美辛胶原蛋白烧伤膜

磺胺嘧啶银胶原蛋白烧伤膜

异型双功能交联剂SPDP

N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯交联剂

马来酰亚胺基烷基酯蛋白质交联剂

间–马莱酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯/m-MBS交联剂

N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯SPDP

Sulfo-SMCC交联剂

TLS11a-Fc双功能性复合物

N,N￠–亚甲基双丙烯酰胺交联剂

蛋白质二聚体交联剂

N-唬拍酞亚胺一3(2一二硫毗咤)丙酸醋异型双功能交联剂

BSA一CAT的双聚体交联剂

牛血清白蛋白偶联过氧化氢酶双聚体

免疫毒素交联剂

穿膜肽–增强型绿色荧光蛋白–抗体–蛋白微球三联偶联物

TAT-EGFP-IgG-BSA-NS偶联物

穿膜肽–蛋白微球二联偶联物/BSA-NS

穿膜肽–抗体–蛋白微球三联偶联物

异型双功能蛋白交联剂N-唬拍酞胺-3-(2-毗吮二硫)-丙酸醋(SPDP)

穿膜肽–β–葡萄糖苷酶偶联物

双功能化学交联剂

CD56+CD16+NK细胞

新型长侧链双羧基功能单体N-(p-乙烯基苄基)-N,N-二[2-(3-羧基丙酰氧基)乙基]胺

N,N'-亚甲基双丙烯酰胺–多孔聚偏二氟乙烯膜

分子印迹聚合物复合膜

对链球菌-Tactin树脂交联剂

双(磺基)辛二酸酯(BS3)双链球菌标记蛋白

环氧基团同型双功能交联剂

血红蛋白蛋白质双功能交联剂

血清白蛋白蛋白质双功能交联剂

卵清蛋白蛋白质双功能交联剂

干扰素蛋白质双功能交联剂

集落刺激因子蛋白质双功能交联剂

胰岛素蛋白质双功能交联剂

聚合血红蛋白交联剂

蛋白–细胞偶联双功能交联剂

异氰酸盐共价交联蛋白质至红细胞

Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白双功能交联剂

半胱氨酸残基蛋白交联剂

转谷氨酰胺酶(TG)蛋白交联剂

过氧化酶(POD)蛋白交联剂

多酚氧化酶(PPO)蛋白交联剂

SMCC/DSS/DST/MBS/SPDP蛋白交联剂

葡萄球菌A蛋白–聚乙烯亚胺交联物SPA-PEI交联物

N,N'-亚甲基双丙烯酰胺交联剂

异型双功能交联剂Sulfo-SMCC

PEG3500辅助交联剂HDA

C225偶联磁性白蛋白纳米球/MANs

聚合血红蛋白聚合产物二聚体

血红蛋白分子印迹聚合物

2-甲氧基雌二醇白蛋白纳米粒/2-ME-BSANPs

人乳腺癌特异性纳米粒/HER2-2-ME-BSANPs

双功能交联剂伴刀豆球蛋白/Con A

环氧基团的γ–环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷/γ-GPTMS功能性–交联试剂

HRP-GOD/GPTMS/CS/Au

HRP-GOD/CS/Au

HRP-GOD/Con A/CS生物复合物膜

穿膜肽偶联白蛋白微球TAT-EGFP/BSA-NP

戊二醛异型双功能交联剂

双功能交联剂GMBS

HCV异型双功能交联剂

C33核心肽异型双功能交联剂

促红细胞生成素异型双功能交联剂

青霉素异型双功能交联剂

双功能交联剂琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯

poly(AHA-co-PMA-co-EDMA)整体柱

PETA/EDMA交联剂

双功能蛋白质亲和毛细管整体柱

双功能交联剂4-乙烯基苯硼酸/乙烯基膦酸VPBA-VPA-EDMA

血红蛋白分子印迹功能化复合磁球(Fe3O4-SiO2-Hb-MIPs)

蛋白功能化胶体晶体水凝胶微球

三臂式功能化学交联剂

功能化氧化石墨烯交联剂

氧化石墨烯功能化聚合物整体柱

聚丙烯酰胺功能化树脂交联剂

环氧氯丙烷/ECH交联剂

N,N-亚甲基丙烯酰胺MBA交联剂

丙烯酰胺AM交联剂

甲基丙烯酸β–羟乙酯HEMA交联剂

木质素磺酸钠水凝胶/LS-P-AM-HEMA

双功能蛋白交联剂

功能化蛋白交联剂

零长度交联剂

同端双功能交联剂

异端双功能交联剂

氘代交联剂

生物素交联试剂

同源交联剂

异源交联剂

光反应交联剂

细胞裂解，亲和纯化和电泳

生物导弹研究（靶向药物）

载体蛋白与半抗原的连接

蛋白质间相互作用研究

蛋白质或其他分子的固相化

抗体的标记、标记转移

特色蛋白交联

同型双功能氨基反应性蛋白交联剂

氨基–氨基交联剂

巯基–糖类交联剂

巯基–巯基交联剂

光反应性–交联剂

氨基–巯基交联剂

化学选择性连接交联剂

体内交联

羧基–氨基交联剂

蛋白标记和交联专题

蛋白标记

荧光蛋白标记

蛋白修饰

蛋白交联

生物素化

聚乙二醇化

Sulfo-SMCC

辛二酸二琥珀酰亚胺, DSS

二硫代双（琥珀酰亚胺丙酸酯）,DSP

NH2/Amine 氨基–蛋白交联剂

COOH 羧酸–蛋白交联剂

MAL马来酰亚胺–蛋白交联剂

N-羟基琥珀酰亚胺–蛋白交联剂

N3/azide 叠氮–蛋白交联剂

Alkyne 炔基–蛋白交联剂

SH/Thiol 炔基–蛋白交联剂

Biotin 生物素–蛋白交联剂

CHO aldehyde 醛基乙醛–蛋白交联剂

OPSS 邻吡啶二硫巯基吡啶–蛋白交联剂

OH hydroxyI/羟基–蛋白交联剂

Hydrazide, HZ/酰基–蛋白交联剂

Silhaie/硅烷–蛋白交联剂

Acrylates (ACRL)/丙烯酸酯–蛋白交联剂

Lipoic acid LA/硫辛酸–蛋白交联剂

Tosyl, Tosylate/甲苯磺酸酯–蛋白交联剂

Acetylthio/乙酰硫基–蛋白交联剂

Aminooxy/氨甲基–蛋白交联剂

NPC/硝基苯碳酸盐–蛋白交联剂

SAS/SC/SCM/SG/SS/SVA-蛋白交联剂

EPOX/环氧化物–蛋白交联剂

(VA)缬草酸–蛋白交联剂

Acrylamide/丙烯酰胺–蛋白交联剂

(Br)/溴化物–蛋白交联剂

(VS) 乙烯砜–蛋白交联剂

MA/甲基丙烯酸酯–蛋白交联剂

(IA)/碘乙酸盐–蛋白交联剂

Chloride/氯化物–蛋白交联剂

DBCO/二苯基环辛炔–蛋白交联剂

TZ/四嗪–蛋白交联剂

Folate/FA/叶酸–蛋白交联剂

Multi-Arms (4 arm 8arm)  多臂PEG-蛋白交联剂

Protected Amines(FMOC,tBOC)-蛋白交联剂

CHEMS/半琥珀酸胆固醇–蛋白交联剂

Phenyl/苯基–蛋白交联剂

phosphoric acid/磷酸–蛋白交联剂

上述产品金畔生物均可供应，仅用于科研，不可用于人体实验！

wyf 03.29