蛋白质凝胶电泳的原理是什么？有何注意事项？

你知道蛋白质凝胶电泳的原理是什么吗？有何注意事项？让我们一起来看看吧！

一、原理

将蛋白质样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS)以及硫基乙醇一起加热，使蛋白质变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链考疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线性关系。

二、注意事项

1. 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶称、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止引现象，所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡沫海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。

2. 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽板梳齿应平整光滑。

3. 在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶乡合后进行。洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。

4. 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或过低无可影响电泳效果。

5. SDS纯度：在SDS-PAGE中，需高纯度的SDS,市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下：称20g SDS放在圆底烧瓶中，加300ml无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min,用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明，冷却至室温后，移至-20℃冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量-20℃预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。

6. 用SDS处理蛋白质样品时，每次都会在沸水溶中保温3——5min,以免有亚稳聚合物存在。

7. 对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10-15μl为宜，如样品系较稀的液体状，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。

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蛋白质含量测定方法有哪些？

蛋白质含量测定实验可以用于测定蛋白质浓度和检测所提取的蛋白质含量，那么蛋白质含量测定方法有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、folin—酚试剂法

这种蛋白质测定法是zui灵敏的方法之一。过去此法是应用zui广泛的一种方法，由于其试剂的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

folin-酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯yi酸（0.5%），乙醇（5%），yi醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

二、考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

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不同动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤是怎样的？

你知道不同动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤是怎样的吗？让我们一起来看看吧！

一、培养的贴壁动物细胞的蛋白质抽提步骤

1.从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。

2.预冷的 PBS 清洗贴壁的细胞 2 次，小心倾去 PBS。

3.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml 抽提试剂中加入 5 μl 蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF 和 5 μl 磷酸酶混合液）。

4.细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（107 个细胞中加入 1ml 抽提试剂；5×106 个细胞中加入 0.5ml 抽提试剂），轻轻摇动 5 分钟。

5.用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动 15 分钟进行裂解。

6.裂解液于预冷的离心机中 14，000xg 离心 15 分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

二、培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤

1.2500xg 离心 10 分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液

2.预冷的 PBS 悬浮沉淀细胞，2500xg 离心 10 分钟沉淀细胞，去上清。

3.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml 抽提试剂中加入 5 μl 蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF 和 5 μl 磷酸酶混合液）。

4.加入含抑制剂的预冷蛋白质抽提试剂（107 个细胞中加入 1ml 抽提试剂；5×106 个细胞中加入 0.5ml 抽提试剂）。

5.轻轻摇动混和 15 分钟进行裂解。

6.裂解液于预冷的离心机中 14，000xg 离心 15 分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

三、哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤

1.组织称重，切小块放入管中。

2.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml 抽提试剂中加入 5 μl 蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF 和 5ul 磷酸酶混合液）。

3.加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg 组织中加入 1ml 抽提试剂）。

4.用匀浆器每次 30 秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴 1 分钟，至组织wan全裂解。

5.裂解液于预冷的离心机中 14，000xg 离心 15 分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

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蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么？

在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，那么你知道蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、注意事项：

1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。

2、浓度不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。

3、选择合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。

5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。

8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。

二、常见问题：

1、通过 His 标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？

（1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

（3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。

2、镍柱使用中出现棕色的原因

（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心，并过0.22或者0.45的膜。

（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入 1-2mM DTT （上清样品处理要在冰浴中进行），还不行加尿素变性，使其在变形环境下。

（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。

3、纯化过程中蛋白出现了浑浊应如何处理？

（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂 DTT。

（2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。

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蛋白质生产的细胞类型有什么？

在悬浮培养大规模生产中，常用的细胞类型有什么呢？让我们一起来看看吧！

一、真核细胞：真核细胞是具有真核细胞核的细胞，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞和酵母细胞等。真核细胞通常被用于大规模生产复杂蛋白质，如重组蛋白质、抗体等。以下是常用的真核细胞类型：

1.CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cells）：CHO细胞是一种常用的哺乳动物细胞，被广泛应用于大规模生产蛋白质。CHO细胞具有较高的产量和较好的蛋白质折叠和糖基化能力，同时易于培养和扩展。

2.HEK293细胞（Human Embryonic Kidney cells）：HEK293细胞是来自人类胚胎肾脏的细胞系，也常被用于大规模生产蛋白质。HEK293细胞具有高产量和较好的蛋白质折叠能力，但相比CHO细胞，其糖基化能力较差。

3. BHK细胞（Baby Hamster Kidney cells）：BHK细胞是源自小鼠胚胎的哺乳动物细胞系。BHK细胞常用于病毒研究和生物药物生产中，特别是疫苗和蛋白质表达。

4. 昆虫细胞：昆虫细胞，如昆虫卵巢细胞（Sf9、Sf21）和昆虫脾脏细胞（High Five），也常被用于大规模生产蛋白质。昆虫细胞具有高产量，培养条件较简单，并且能够实现蛋白质正常折叠和糖基化，但其表达的蛋白质往往需要进一步纯化和修饰。

5. 酵母细胞：酵母细胞，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和甘酒酵母（Pichia pastoris），也常被用于大规模生产蛋白质。酵母细胞具有高产量和较好的蛋白质折叠能力，同时易于培养和扩展。特别是甘酒酵母，能够实现糖基化和区分性泛素化等重要后翻译修饰。

二、原核细胞：原核细胞是没有真核细胞核的细胞。原核细胞常被用于大规模生产简单蛋白质、酶类和多肽等。以下是常用的原核细胞类型：

大肠杆菌（Escherichia coli）：大肠杆菌是zui常用的原核细胞，被广泛应用于大规模生产蛋白质。大肠杆菌具有高产量、培养条件简单和易于扩展的特点，但由于其为原核细胞，其表达的蛋白质缺乏糖基化和蛋白质折叠较复杂。

三、植物细胞：

植物细胞，如鸟嘌呤二核苷酸酶(PMP)和转基因植物的细胞，近年来在大规模生产蛋白质方面也得到了广泛研究。植物细胞有很高的产量潜力和较好的蛋白质折叠机制，并且可以实现重要的翻译后修饰，如糖基化。此外，植物细胞还有易于培养和扩展的特点，以及低成本和低传染性等优势。

四、鱼类细胞：

近年来，鲤鱼细胞(LC3)和鲈鱼卵巢细胞(SDJY)等鱼类细胞也成为了大规模生产蛋白质的新型候选细胞。鱼类细胞在表达复杂蛋白质时具有出色的折叠机制和高产量特点，因此在蛋白质生产中表现良好。

悬浮培养大规模生产中常用的细胞类型包括CHO细胞、HEK293细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和酵母细胞等。每种细胞类型具有不同的特点和应用范围，选择合适的细胞类型可以提高蛋白质生产效率和产品质量。更多有关蛋白质生产的细胞类型，请联系上海金畔生物科技有限公司：

蛋白质纯化都有哪些方法？

蛋白纯化是指通过基因工程技术将编码蛋白的核酸序列导入到宿主细胞，使其大量表达，再使用适当的纯化方法将其在体外纯化出来，从而获得高纯度、活性和产量的蛋白质。那么蛋白质纯化方法都有什么呢？让我们一起来看看吧！

一、凝胶过滤层析：

根据分子大小从混合物中分离蛋白质，不同蛋白的形状及分子大小存在差异，在混合物通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于各种蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异，大的蛋白分子会被先洗脱出来，分子越小越晚洗脱。

二、离子交换层析：

依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化，蛋白表面通常会均匀带有一定的电荷，在一定条件下可以与阳/阴离子交换柱结合。在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，与离子交换柱的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同。

三、疏水作用层析：

利用蛋白质的疏水性，蛋白经变性处理或处于高盐环境下疏水残基会暴露于蛋白表面，不同蛋白疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱不同，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水用作由弱至强的组分分离。

四、亲和层析：

把待纯化的某一蛋白质（或在蛋白质上加上标签）的特异配体通过适当的化学方法共价连接到载体分子上，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的蛋白质与配体特异性结合，而其他蛋白质则不被结合，通过洗涤除去，被特异结合的蛋白质可以用含游离的相应配体溶液洗脱下来。

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