原代细胞培养分离的注意事项

运输胎牛血清的注意事项

胎牛血清在许多细胞培养和生物制药领域都被广泛应用。由于其含有丰富的营养物质和生长因子，胎牛血清可以为细胞提供必要的生长条件和支持细胞增殖。它被用作培养细胞和组织、制备疫苗、抗体和其他生物制剂的原料，以及用于生物医药研究和临床诊断。那么你知道胎牛血清在运输过程中有何注意事项吗？让我们一起来看看吧！

1. 温度控制：胎牛血清的运输过程中，温度控制至关重要。血清应在冷链条件下运输，以确保其稳定性和活性。最佳的运输温度通常在2°C至8°C之间。运输过程中应使用合适的冷藏设备，并确保温度监控系统的正常运作。

2. 包装和标记：血清需妥善包装和标记，以防止在运输过程中发生破损或混淆。运输容器应具备适当的保护性能，以抵御外部冲击和振动。标记应清晰可见，包含必要的信息，如血清的批号、过期日期和储存条件。

3. 避光：血清需避免阳光直射或其他强光照射。过度曝光于光线下可能会导致血清中的成分发生降解或失活。

4. 避免交叉污染：为了避免交叉污染和感染风险，应在运输过程中采取严格的卫生措施。运输容器和包装材料应事先消毒，并确保运输过程中的密封性。

5. 运输文件和记录：确保血清运输的文件和记录完整准确。这包括血清的起始温度、运输时的温度监控记录、运输日期和时间、运输路线等信息。这些记录将有助于追踪和验证血清的质量。

中科百抗胎牛血清采用严格的保存和运输流程。生产过程中的每一步，血源采集、加工、过滤、辐照处理、包装、质检和物流等，都必须遵循行业高标准，以确保产品的优异品质。

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细胞消化的注意事项有什么？

免疫荧光实验的常见问题与注意事项

胎牛血清在使用过程中的注意事项有哪些？

胎牛血清是一种常用的细胞培养基添加剂，通常用于增强细胞的生长和增殖能力。那么你知道胎牛血清在使用过程中的注意事项有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损

血清解冻时应将血清从-15~-70℃的低温冰箱中取出放入4℃冰箱解冻1天，待全部解冻后再分装。解冻过程中请不时摇匀（小心勿造成气泡），使血清成分和温度均匀，从而减少沉淀的产生。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻，并避免反复冻融。需要长期保存的血清必须储存于-20℃到–70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会被破坏，而影响血清质量。

二、有时在血清中见到的絮状沉淀可能是些什么物质

主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量，可用400 xg离心5 min去除，也可不用处理。

三、如何避免血清中产生沉淀

(1) 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(2) 血清分装冻存时，须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一。

(3) 勿直接由-20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

(4) 勿将血清置于37℃太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成份也会因此受到破坏，从而影响血清的品质。

(5) 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，无须做此步骤。

(6) 若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

四、热灭活对血清的作用是什么

热灭活步骤能够灭活补体系统。补体会参与以下事件中：溶解细胞事件，平滑肌收缩，肥大细胞与血小板释放组胺，吞噬作用增强，趋化作用，淋巴细胞与巨噬细胞的活化等。

五、加到培养基中的血清必须灭活吗

不是必须的，看做什么实验。如果用于培养普通细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。

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免疫荧光实验的注意事项有什么？

免疫荧光（IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项检测技术。可用于检测和识别细胞和组织中蛋白质及其他分子的亚细胞分布和迁移。那么你知道免疫荧光实验的注意事项有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、设置对照

可以使用阳性和阴性对照来确定结果的准确性，并帮助确定任何问题的来源。

二、样品和试剂的存储

由于IF中所用抗体和实验样品的荧光性质，因此必须适当存储。最好将荧光抗体和经过IF处理的样品都保存在wan全黑暗的环境中。使用琥珀色或铝箔覆盖抗体管。

三、使用适当的固定剂

醛可用于标记膜结合抗原或细胞骨架抗原，并应用于核蛋白或线粒体蛋白。醛固定后的样本需要抗原修复和打孔渗透步骤才能正确检测抗原。如果使用单克隆抗体推荐有机溶剂用于组织固定。甲醇适用于冷冻样本的固定；丙酮固定对组织学保存效

四、仔细选择抗体

应检查所有抗体，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，以确保与目标抗原具有高的亲和力。所用的二抗必须与一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗检测小鼠来源的一抗。

五、多色染色

最好使用在不同物种中产生的一抗。如果使用间接检测，请使用已预先吸附在检测其他蛋白质的一抗和二抗的种属以及实验样品的物种中的二抗。这样可以zui大程度地减少跨物种的反应性和非特异性结合。所有二抗也应在同一物种中产生，以zui大程度地减少交叉反应。

六、决定直接或间接染色

两种方法都有优点和缺点，根据实验需求选择。使用这两种方法，都应该确保充足的洗涤以最小化非特异性的结合。

七、选择没有光谱重叠的荧光团

IF是一种很好的多路复用分析技术，测量如此多的参数，那么使用能够提供可分辨信号的荧光团是很有必要的。

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蛋白质凝胶电泳的原理是什么？有何注意事项？

你知道蛋白质凝胶电泳的原理是什么吗？有何注意事项？让我们一起来看看吧！

一、原理

将蛋白质样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS)以及硫基乙醇一起加热，使蛋白质变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链考疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线性关系。

二、注意事项

1. 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶称、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止引现象，所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡沫海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。

2. 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽板梳齿应平整光滑。

3. 在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶乡合后进行。洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。

4. 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或过低无可影响电泳效果。

5. SDS纯度：在SDS-PAGE中，需高纯度的SDS,市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下：称20g SDS放在圆底烧瓶中，加300ml无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min,用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明，冷却至室温后，移至-20℃冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量-20℃预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。

6. 用SDS处理蛋白质样品时，每次都会在沸水溶中保温3——5min,以免有亚稳聚合物存在。

7. 对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10-15μl为宜，如样品系较稀的液体状，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。

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悬浮细胞培养的操作步骤与注意事项有哪些？

悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，那么悬浮细胞培养的操作步骤与注意事项有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、步骤

1. 将准备好的冻存细胞放入37℃水浴中解冻。

2. 用70%乙醇对顶端进行消毒，用吸管将细胞转移到含有5mlwan全MEM-10培养基的25cm2组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，放入5%CO2加湿培养箱中37℃培养过夜。

3. 将培养基吸出，用0.5ml37℃的胰酶/EDTA覆盖细胞，消化30~40s。

4. 加入10ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞转移至50ml的离心管中。室温1800g离心5min，弃上清。

5. 将细胞沉淀悬浮在5ml的旋转瓶wan全培养基-5中，上下吹打，将细胞团打散。

6. 在100ml或200ml通气旋转瓶中加入50ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞悬液转移到瓶中。

7. 取出1ml细胞悬液，用血细胞计数器进行细胞计数。加入适量的旋转瓶wan全培养基-5，使细胞密度为（3~4）×105细胞/ml。将细胞放入无CO2培养箱，37℃旋转培养。

8. 随后的两天让细胞继续生长，并且每天对细胞进行计数，加入适量的旋转瓶wan全培养基-5以维持（3~4）×105细胞/ml的细胞密度。

9. 取1ml的细胞悬液，用血细胞计数器对细胞进行监测。

10. 当细胞密度达到（4~5）×105细胞/ml时，隔天或每天用培养基将细胞稀释至1.5×105或2.5×105细胞/ml。

11. 分别将装有50ml或100ml细胞悬液的100ml或200ml通气旋转瓶放入37℃无CO2培养箱旋转培养。每天或隔天传代。

二、注意事项

由于有些细胞是不能被养活的，所以需要高的初始密度。

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原代细胞培养的分离注意事项有什么？

分离是原代细胞培养的重要步骤之一，那么你知道原代细胞培养的分离注意事项有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、组织块培养法

1.组织块接种后的前3天，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。

2.加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。

3.当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。

4.为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。

二、贴壁型原代细胞

1.原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，它们之间会互相影响，在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。

2.适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。

3.尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

三、悬浮型原代细胞

1.必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以5ml为zui低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。

2.能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。

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原代细胞取材的注意事项有哪些？

取材作为原代细胞培养过程中至关重要的一步，那么原代细胞取材的注意事项有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、皮肤和粘膜

主要取皮片，面积一般2~4平方厘米。

二、内脏和实体瘤

1.无菌环境；

2.熟悉所需组织的类型和部位；

3.要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。

三、血液细胞

一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中(如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等)分离细胞，取材时应注意抗凝。

四、骨髓、羊水、胸/腹水细胞

严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。

五、动物组织取材——鼠胚组织

1.用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物；

2.将其浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后取出动物；

3.在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤；

4.用无菌操作法解剖取胚。

六、动物组织取材——幼鼠胚肾(或肺)

幼鼠采用上述方法处死消毒后→腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧→采用无菌法打开胸腔取肺，或从背部打开腹腔取肾。

七、鸡(鸭)鸟类胚胎组织

1.取孵化至适当胚龄(9~12天)的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置；

2.将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干;

经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳;

3.用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚;

4.用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。

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蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么？

在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，那么你知道蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、注意事项：

1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。

2、浓度不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。

3、选择合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。

5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。

8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。

二、常见问题：

1、通过 His 标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？

（1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

（3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。

2、镍柱使用中出现棕色的原因

（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心，并过0.22或者0.45的膜。

（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入 1-2mM DTT （上清样品处理要在冰浴中进行），还不行加尿素变性，使其在变形环境下。

（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。

3、纯化过程中蛋白出现了浑浊应如何处理？

（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂 DTT。

（2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。

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细胞复苏有何注意事项？

细胞复苏是指将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。那么你知道在细胞复苏过程中有何注意事项吗？让我们一起来看看吧！

1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套，护目镜。如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。

2. 细胞放入水浴中复苏时注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。

3. 打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。注意无菌操作，细胞复苏后的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。

4. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导致细胞复苏后的生长状态不佳。

5. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染，实验室定期用过氧化氢熏蒸，细胞小黑点增多时用支原体检测试剂盒检测，并且及时清除。

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细胞冻存有何注意事项？

细胞低温冻存是培养室常用技术。原理是将细胞放在-196℃液氮中，可以使细胞暂时脱离生长状态，减少细胞代谢，理论上储存时间几乎是无限的。那么细胞冻存有何注意事项呢？让我们一起来看看吧！

一、DMS0稀释时会释放大量热量，不能直接加到细胞液中，须事先配制，且DMSO必须是细胞培养级别的；

二、缓慢冷冻，细胞逐步脱水，不会因产生大的冰晶而受到损害；

三、选择细胞生长良好、密度约为80-90%、活力达90%以上的细胞冻存；

四、冻存时细胞密度少于5X105个活细胞/mL时，很难成功复苏；

五、细胞不可长期保存在-80°C冰箱中。我们建议在-80°C冰箱中的保存时间不要超过48h，放入液氮中保存；

六、冻存细胞操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤；

七、冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成支原体污染；

八、定期检查液氮储备，保证细胞全部浸在液面下；

九、冻存细胞时在每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册，避免取错细胞，找不到冻存管等情况；

十、细胞在冷冻过程中在-20C冰箱内放置时间不可超过1小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。

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肿瘤组织的原代细胞培养有哪些注意事项？

原代培养是直接从生物体组织或器官的一部分进行培养，也称初代培养。肿瘤组织的原代细胞培养技术为肿瘤研究及治疗提供充足的细胞来源是癌症在体外研究的重要工具，与体内研究相辅相成。但目前肿瘤细胞原代培养成功率不高的许多问题还需继续探讨与研究。肿瘤组织的原代细胞培养有哪些注意事项？让我们一起来看看吧！

注意点一：取材部位的选择非常重要，应在癌细胞集中、细胞活力较好的部位取材，尽量避免在坏死区取材；

注意点二：取材后应尽快培养，最好不要超过24h，如需耽搁时间，可将组织块于培养液中浸泡，放置于冰浴或4℃冰箱；

注意点三：癌组织周围的血液、脂肪等正常的组织应去除，可以保证癌细胞的纯度；

注意点四：取材方法：获取的组织块最好能有指尖大小，太小了可能养不起来，因为细胞有生物学环境，细胞多了长得也会快，如果细胞密度太低了，细胞很难长起来，可能的原因是细胞分泌的生长因子。

注意点五：切碎癌组织时，可用眼科剪，也可用小刀，避免用大剪刀，所用刀剪要锋利，以免挫伤细胞。

注意点六：分散细胞的方法：机械和药物两种方法。癌组织不同与正常组织，单纯用机械的剪碎办法，癌细胞就可以游离出来，成为细胞悬液。常用胰蛋白酶、EDTA消化分离。如果从含有大量坚硬的结缔组织分离癌细胞，胶原纤维不能被胰蛋白酶和EDTA消化，则使用胶原蛋白酶消化，如：原代黑色素瘤细胞，黑色素瘤一般长在肢端，肢端的角质层太厚，就需要胶原蛋白酶消化。

注意点七：接种数量要足够，造成培养细胞所必须的生物学环境；

注意点八：更换培养液的时可换半量或1/4量，将pH维持在7.2-7.4；

注意点九：新配试剂要做无菌实验，严格无菌操作，防止污染，新手建议不要直接养原代，先拿实验室的肿瘤细胞养养练练手；

注意点十：若组织在消化时间较长时仍未散开，可采用多次提取消化法以减少酶对已消化下来的细胞的损伤；

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