什么是文库构建？
基于NGS测序的诸多优点，故此技术在全球测序市场上占有着绝对的优势位置，而新一代测序（NGS）文库制备是一体化测序流程中的一个关键因素，那么什么是文库构建呢？让我们一起来看看吧！
基因文库是储存了某种生物的DNA片段的受体菌的集合体。文库分为储存全部DNA片段和部分DNA片段，前者叫基因组文库，后者包括cDNA文库。
文库构建的基础是将目标RNA或DNA制备成可以和测序仪器兼容的形式。从组织或者细胞中将DNA或RNA提取出来，并通过机械破碎或者是酶切法对其进行片段化。如果前面提取的是RNA样本，则需要将RNA逆转录为cDNA。对DNA进行接头的连接后，一般还会有一个文库的扩增，即通过PCR来对所需的目的片段进行扩增，然后进行上机测序。
传统的DNA文库构建包括：DNA片段化（超声法）、末端修复、加A、接头连接和PCR文库扩增等过程（Figure 1）。整个实验对DNA起始量、仪器有一定的要求。
新型的文库构建方法利用转座酶的转座原理，对DNA进行片段化并同时加上部分接头序列，是建库过程中是一个重大的进步。
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NGS测序之文库构建
由于二代测序读长的限制，不可能一下将一个很长的基因序列测通，因此需要先将长基因序列随机片段化成小片段，这样的话，这些片段就可以覆盖整个基因组。所以需要构建文库。
一、文库构建的步骤
文库构建大致步骤类似，但是各有各自du特的点，例如，RNAseq里miRNA，lncRNA，mRNA方法各有差异，具体方法以后有机会再补充。这里以Illumina的 PE文库为例，其流程图如下图。
二、文库构建详细步骤
（1）DNA片段化 （Fragment DNA）
使用超声、酶或者加热的方式将DNA样品打碎成小片段，一般在300 ~ 800bp之间除非有特殊要求。
（2）末端修复（End Repair）
补平片段化时导致的不平末端。
（3）3' 末端加“A” （A-tailing）
3‘ 末端加A，转换为粘性末端，与adapter 互补配对，因为adapter 3‘端有一个突出的T。
（4）接头连接（ ligation adaptor）
这一步有两种不同的添加策略如下图。
左边的图是直接在fragment DNA的两端直接加上full Y-adapter, adapter中已经包括了和P5/P7 oligo互补的序列, index, 以及Read1/Read2的测序引物。
右边的图是先在fragment DNA的两端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互补配对的序列以及index序列，分两步：
A. PE adapter添加利用碱基互补配对的原则，加上PE adapter。PE adpater中一部分是建库PCR富集时候需要用的引物序列，另一部分是测序时需要用的引物。
B.PCR 添加 index，P5，P7
Index也称barcode，用来区分不同样本的文库，因为测序仪一个lane产生数据量若干Gb，为了最da化利用测序仪，一次上机常会进行多个样本文库混合测序，在后续分析时，Index用来区分数据是来自哪个样本。
● PCR富集目的片段
进行PCR扩增，循环数与投入的DNA量有关，使得文库达到上机浓度。
● 扩增文库大小质检
使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测。
● 文库浓度定量
Qubit3.0 进行初步定量 Q-PCR对文库的有效浓度进行准确定量，至此文库构建结束。
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NGS测序为什么需要文库构建?
NGS即Next-generation sequencing，又叫第二代测序技术或者高通量测序技术或者下一代测序技术。
文库是DNA/RNA样本在测序前做的一系列准备，因为原始的核酸样本无法直接用于测序，只有经过处理的样本才能满足测序平台的要求，比如在DNA样本两端添加测序bi备的接头；样本量不足时，可以通过PCR扩增达到上机的要求等。NGS测序为什么需要文库构建?让我们一起来看看吧！
一、DNA文库构建的内容
（1）片段化及末端修复
（2）加接头
（3）PCR
注意：此处忽略磁珠纯化的步骤。
RNA样本的文库构建更加复杂，需将RNA逆转录为cDNA才能进行上述的建库流程，原理相同。
二、gDNA样本在NGS建库前要进行片段化的原因
Illumina测序仪可读取的片段长度范围在50-600bp（图1）, 不同测序芯片和测序试剂，对应测序长度不同。而大部分完整人类gDNA长度≥10kb。所以对于大片段的DNA/RNA样本，打断是文库构建的前提。(这个理由同样适用于MGI平台)
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DNA测序应用 |
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应用 |
推荐读长 |
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全基因组测序 |
2 X 150 bp |
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全外显子测序 |
2 X 150 bp |
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靶向捕获测序 |
2 X 150 bp |
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扩增测序 |
整个扩增子插入片段长度 |
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从头测序 |
2 X 150 – 2 X 300 bp |
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RNA测序应用 |
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应用 |
推荐读长 |
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转录组分析 |
2 X 75 bp |
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基因表达谱分析 |
1 X 50 bp |
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小RNA测序 |
1 X 50 bp |
图1.Illumina测序平台针对不同应用推荐的测序读长
三、DNA片段化后要加接头(adapter/index)的原因和意义
一个完整的接头包含三部分:通用引物(P5&P7) + index(i7/i5) + 测序引物(SP1&SP2)（图2）
1. 通用引物用于簇生成，测序引物用于插入片段的测序；
2. 测序平台决定接头序列;
3. index用于区分同一批测序数据的不同样本。当同一张芯片测序样本数≥2时，由index来区分样本。如果一张flow cell只上一个样本，index可以不需要，但是通用引物(P5&P7)和测序引物(SP1&SP2)是必需的。
备注：样本加上完整接头的方式有至少有3种，但是最终文库的接头序列是一致，找时间专门写一个接头不同结构与连接方式的文章。
图2 不同接头结构的文库
四、PCR和PCR-free两种文库的常见性问题
PCR是实现样本量的手段之一。当投入的起始量较低，构建的文库量较少，需要通过 PCR复制模板量，最终达到上机需求的量。反之，当样本起始量足够多的情况下，只需完成接头连接，纯化后即可上机测序。
但是PCR文库比较常见。
1. 大部分样本的起始量并不能直接满足上机需求
2. 不经过PCR扩增的文库，由于接头呈现Y型，其物理结构特殊，容易导致文库质控结果出现偏差
3. 接头与模板比例高，纯化不干净，导致文库的接头残留严重，降低整个文库质量
五、不同试剂盒对样本起始量要求不同
不同试剂盒会有不同的样本起始量要求。试剂盒能满足的样本起始量主要是由它自身酶的灵敏度、特异性以及稳定性决定的。样本起始量越低 (如新冠鼻咽拭子样本)，对酶的要求越高，相对的价格也越高。而且针对低起始量样本建库的试剂盒都有各自的技术zhuan利和优势，所以也是价格高的另一个原因。
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酵母双杂交文库构建技术服务
酵母双杂交文库构建技术服务介绍
酵母双杂交技术产生以来，主要应用在以下几个方向：
1、检验一对功能已知蛋白间的相互作用。
2、 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。
3、 用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。
4、分析新基因的生物学功能，即以功能未知的新基因去筛选文库。通常依靠报告基因的转录激活来鉴定蛋白相互作用。将一个基因克隆到”诱饵”载体，并和GAL4蛋白的DNA结合域(DBD)表达为融合蛋白。将第二个基因或者编码可能的相互作用子蛋白的cDNA文库克隆到”猎物”载体，同GAL4的转录激活域(AD)表达为融合蛋白。当两个蛋白相互作用时，AD和DBD间距离被拉近，从而激活报告基因的表达。
本服务项目使用infusion重组系统进行重组，使用zhuan利的cDNA合成方法进行cDNA的合成。
实验步骤
1.1.RNA提取
1.2.mRNA分离
1.3.cDNA合成（使用酶促法直接合成，不经过PCR扩增过程，比SMART方法质量大大提高）
1.4.cDNA长度分级
1.5.分级后的cDNA与酵母双杂载体(pGADT7、pGADT7-REc2、pDEST22、pB42AD、pPR3N等载体，或者客户载体)进行infusion重组。
1.6.重组后产物电转化感受态细胞
1.7.文库铺板检测与菌液保存
1.8.文库质粒提取
产品内容
我们提供构建好的酵母文库的甘油菌液（含20%甘油的LB培养基），文库甘油菌，随机克隆子的PCR鉴定图谱，文库构建报告，酵母双杂交筛选相关细胞和质粒。
质量标准
3.1文库库容量：大于1*10^7CFU。
3.2平均插入片段：大于1.2Kbp。
3.3阳性率：大于95%。
服务时间
20个工作日内
备注1：该酵母文库可以选择增加均一化处理步骤，我们使用DSN法均一化方法，可以构建出高质量的均一化酵母杂交文库，可以大大减少后续酵母筛选的工作量和筛选效率等。
提供的产品
详细的实验报告
酵母双杂交（酵母单杂交）文库质粒、菌液
备注2：如果客户需要转化酵母，我们可提供100管酵母甘油菌工作液及母液（同clontech）。
服务周期
获得合格的总RNA后25工作日，如需转化酵母延长15个工作日。
材料要求
客户构建的酵母双杂交cDNA文库，由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可：细胞样本：细胞数量大于1*10^7
动物样本：大于1g
物样本：大于2g
总RNA：大于200u
服务流程
1、提交项目课题相关需求和资料。
2、与我们的专业技术团队讨论项目细节。
3、根据讨论后的意见对实验方案进行修改。
4、双方均满意并达成一致，签订技术服务合同。
5、开展实验，按期完成合同规定的内容。
6、结题，提供实验原始结果和分析结果、实验流程、实验条件等等。
咨询与订购
感谢您选择我们的服务，如果您有任何问题，请联系我们，我们将竭诚为您解答和服务。
上海金畔生物科技有限公司是Lexogen文库制备试剂盒代理商 ，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
Lexogen文库制备试剂盒代理
Lexogen 成立于 2007 年，是转录组学、新一代测序、RNA 分析和生物信息学领域的公司。 Lexogen 是 3' mRNA 测序领域的ling导者，该技术的效率、稳健性和灵敏度均得到验证。 Lexogen 的产品组合包括在奥地利维也纳开发和生产的创新试剂盒，用于真正的单细胞以及批量 RNA 测序、RNA 提取、核糖体 RNA 去除、掺入 RNA 变异控制以及用于 RNA 转录组范围分析的新生 RNA 标记动力学。 Lexogen 还提供可定制的 NGS 服务，从实验设计咨询到样品处理以及定制的生物信息学分析和报告。
Lexogen文库制备试剂盒代理——上海金畔生物科技有限公司，以下是Lexogen品牌部分产品列表：
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产品名称 |
规格 |
价格（欧元） |
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uantSeq 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit for Ion Torrent |
24A preps |
580 |
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QuantSeq 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit FWD for Illumina |
24preps |
580 |
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QuantSeq 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit REV for Illumina |
24preps |
580 |
|
QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq Library Prep Kit V2 |
24preps,with first |
780 |
|
SLAMseq Explorer Kit – Cell Viability Titration Module |
24preps |
456 |
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SLAMseq Explorer Kit – S4U Incorporation Module |
24preps |
589 |
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SLAMseq Kinetics Kit – Anabolic Kinetics Module |
24 preps |
516 |
|
SLAMseq Kinetics Kit – Catabolic Kinetics Module |
24 preps |
574 |
|
SLAMdunk data analysis for SLAMseq integrated on Bluebee platform |
2GB |
93 |
|
SIRV-Set 1 (Iso Mix E0, E1, E2) |
1024 |
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|
SENSE Total RNA-Seq Library Prep Kit |
HiSeq 2000/2500/3000/4000;24preps； |
1395 |
|
oPrime Full-Length cDNA Amplification Kit |
24preps |
1125 |
|
SPLIT RNA Extraction Kit |
280 |
|
|
RiboCop rRNA Depletion Kit V1.2 |
24preps |
888 |
|
Poly(A) RNA Selection Kit |
195 |
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Gel Extraction Module |
50 |
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i7 Index Plate for QuantSeq/SENSE (7001-7096) |
278 |
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UMI Second Strand Synthesis Module for QuantSeq FWD (Illumina, Read 1) |
147 |
|
|
QuantSeq-Flex First Strand Synthesis Module |
200 |
|
|
QuantSeq-Flex Second Strand Synthesis Module V2 |
200 |
Lexogen文库制备试剂盒代理——上海金畔生物代理Lexogen在中国的业务，提供Lexogen品牌全转录组文库制备试剂盒、表达分析文库制备试剂盒、单细胞和低输入 RNA-Seq 文库制备试剂盒等等。
上海金畔生物科技有限公司是Bioline 文库制备试剂盒代理商 ，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
Bioline 文库制备试剂盒代理
Bioline 文库制备试剂盒代理——上海金畔生物科技有限公司，提供Bioline产品，如PCR试剂、文库制备试剂盒等，更多Bioline品牌产品等，欢迎咨询！
Bioline公司介绍：
Bioline成立于1992年，总部位于英国伦敦，是一家不断发展的公司，我们的使命是为客户提供一系列快速易用的产品，保证由了解我们的客户尝试了解的客户的工作和开发实现他们可以专注于他们的科学目标。在Bioline，我们不断努力改进和提供高品质的产品，这是我们对科学的坚定承诺和投资的结果。由Meridian Bioscience Inc.全资拥有的Bioline是一家拥有强大价值的多元文化团队。
Bioline试剂被分子生物学家和其他研究科学家用于从医学，生物技术和海洋生物学到食品和农业技术以及法医和环境科学等许多领域进行测试分析和研究，其中生命科学家已经开始依赖我们的试剂的品质和可靠性。随着Bioline继续在范围内不断发展，我们的目标是为我们的客户提供快速，简便和愉快的Bioline购买体验。我们努力与客户，关键合作伙伴和合作伙伴保持密切，使我们处于新应用领域和技术的前沿，为我们的研发团队提供反馈，并为生物研究试剂市场带来新的可持续解决方案。
Bioline详细产品列表：
|
货号 |
产品 |
规格 |
品牌 |
|
BIO-86005 |
SensiFAST™ Probe No-ROX Kit |
500 x 20µl Reactions |
Bioline |
|
BIO-68028 |
JetSeq™ Library Quantification Hi-ROX Kit |
500 Reactions |
Bioline |
|
BIO-98005 |
SensiFAST™ SYBR® No-ROX Kit |
500 x 20µl Reactions |
Bioline |
|
BIO-96005 |
SensiFAST™ SYBR® & Fluorescein Kit |
500 x 20µl Reactions |
Bioline |
|
BIO-92005 |
SensiFAST™ SYBR® Hi-ROX Kit |
500 x 20µl Reactions |
Bioline |
|
BIO-94005 |
SensiFAST™ SYBR® Lo-ROX Kit |
500 x 20µl Reactions |
Bioline |
|
BIO-83005 |
SensiMix™ II Probe Kit |
500 Reactions |
Bioline |
更多有关Bioline产品介绍，请联系Bioline 文库制备试剂盒代理——上海金畔生物科技有限公司。
上海金畔生物科技有限公司是idtdna文库制备试剂盒代理商 ，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
idtdna文库制备试剂盒代理
idtdna文库制备试剂盒代理——上海金畔生物科技有限公司，提供idtdna产品，如检测试剂盒、NGS文库制备试剂盒等，更多idtdna品牌产品等，欢迎咨询！
idtdna公司介绍：
35多年来，我们一直在为基因组学实验室提供不同于业内任何人的寡核苷酸制造工艺，以及最xian进的合成、修饰、纯化和质量控制能力。
通过我们创始人对创新的执着、最高标准的质量和深厚的基因组学专业知识，IDT已经从一家领xian的寡聚体制造商发展成为一家基因组学解决方案提供商，支持下一代测序、CRISPR、合成生物学和PCR等关键领域，为研究人员在需要时提供正确的工具。通过这些核心努力，IDT团队一直在幕后帮助推动科学进步，提高质量、数量、效率和wu与伦比的客户服务。
今天，技术的发展速度比以往任何时候都快。领导从基础研究向转化研究过渡的科学家面临着新的挑战，他们需要确保将研究从实验室推进到临床所需的定制解决方案。这些新出现的障碍共同减缓了关键发现的速度，可能对人类和生态健康产生深远影响。
为了帮助克服这些障碍并突破技术界限，我们扩大了生产设施和能力，将GMP*和cGMP生产等级包括在内。这些补充为客户提供了一个能够支持整个研究旅程的基因组学解决方案合作伙伴。再加上新的协作灵活性，我们组织的成员和战略合作伙伴将为我们这个时代最伟大的基因组突破做出贡献——指导更有效的疫苗，解决世界饥饿和气候变化问题，并推动复杂疾病的新诊断和治疗。
展望未来，我们的使命——加快基因组学的步伐——尊重我们的遗产，代表我们对追求新思想的承诺，这将帮助我们实现我们的共同愿景，使研究人员能够迅速从实验室走向改变生活的进步。
idtdna详细产品列表：
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货号 |
产品 |
价格 |
品牌 |
|
11-04-02-07 |
2 ml 10X RNaseAlert®-1 Buffer |
$15.00USD |
idtdna |
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11-02-01-02 |
RNaseAlert®-1 Kit |
$155.00 USD |
idtdna |
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11-04-02-03 |
RNaseAlert®-1 Substrate – 2 bulk tubes |
$408.00 USD |
idtdna |
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11-04-03-03 |
RNaseAlert®-1 Substrate – 25 single use tubes |
$105.00 USD |
idtdna |
|
11-01-02-04 |
2 ml 10X DNaseAlertTM Buffer |
$15.00 USD |
idtdna |
|
11-02-01-04 |
DNaseAlertTM Kit |
$124.00 USD |
idtdna |
|
11-04-02-04 |
DNaseAlertTM Substrate – 2 bulk tubes |
$341.00 USD |
idtdna |
|
11-04-03-04 |
DNaseAlertTM Substrate – 25 single use tubes |
$91.00 USD |
idtdna |
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11-05-01-03 |
1 Liter Nuclease Free Duplex Buffer |
$42.00 USD |
idtdna |
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11-01-03-01 |
10 x 2 mL Nuclease Free Duplex Buffer |
$22.00 USD |
idtdna |
|
11-05-01-12 |
300 mL Nuclease Free Duplex Buffer |
$25.00 USD |
idtdna |
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11-05-01-05 |
1 Liter IDTE pH 7.5(1X TE Solution) |
$42.00 USD |
idtdna |
|
11-05-01-09 |
1 Liter IDTE pH 8.0(1X TE Solution) |
$42.00 USD |
idtdna |
|
11-01-02-02 |
10 x 2 mI IDTE pH 7.5(1X TE Solution) |
$25.00 USD |
idtdna |
|
11-01-02-05 |
10 x 2 mIIDTE pH 8.0(1X TE Solution) |
$25.00 USD |
idtdna |
|
11-05-01-15 |
300 mLIDTE pH 7.5(1X TE Solution) |
$25.00 USD |
idtdna |
|
11-05-01-13 |
300 mLIDTE pH 8.0(1X TE Solution) |
$25.00 USD |
idtdna |
更多有关idtdna产品介绍，请联系idtdna文库制备试剂盒代理——上海金畔生物科技有限公司。