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细胞传代培养的常见问题

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细胞传代培养的常见问题

　　细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础。其中，细胞传代是将部分细胞分离出来，重新接种到新的培养皿中，使细胞重新获得足够的营养条件和生长空间的过程。那么你知道细胞传代培养的常见问题有哪些吗？让我们一起来看看吧！
　　1、细胞何时进行传代
　　通常当细胞生长至w全汇合进行传代，避免细胞生长过密，对于特殊情况，比如有接触抑制的细胞，一般在密度70-80%就进行传代，避免引起细胞分化。
　　2、贴壁细胞胰酶消化如何控制时间
　　贴壁细胞培养一个关键步骤胰酶消化，消化过度会导致细胞碎片增多，细胞成片脱落，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失，消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打造成细胞损伤，活性下降。
　　一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要对于新购买的细胞，可以先用低浓度的胰酶去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。
　　3、如何看活细胞
　　可通过显微镜观察：活细胞中间透亮，饱满，有光泽，死细胞较暗。或通过台盼蓝染色来计算细胞活力，活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。有细胞计数仪的，可直接用计数仪计数。
　　4、细胞传几代开始死亡或细胞存活率不佳，增值变慢
　　可能是培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；或者消化过度，对细胞有严重影响；或者是传代比例不合适；细胞存在污染等。
　　更多有关细胞传代培养的常见问题，请联系上海金畔生物科技有限公司。

qPCR实验常见问题及解决方法

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qPCR实验常见问题及解决方法  PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。可以在短时间内将微量的DNA片段扩增到足够数量，用于后续的研究和检测。下面让我们一起来看看qPCR实验的常见问题及解决方法吧！

一、扩增曲线不稳定

可能原因

RNA纯度低；体系中存在较多杂质；仪器使用时间过长。

解决方案

1）提取高纯度的RNA，小心操作。

2）对仪器进行校准。

二、扩增无法达到平台期

可能原因

模板浓度太低；循环数太少；试剂扩增效率低。

解决方案

1) 提高模板量

2) 提高循环数

3) 用标准曲线测定扩增效率，提高镁离子浓度，换用扩增效率高的试剂。

三、荧光下降

可能原因

存在降解；模板浓度过高。

解决方案

1) 提高体系纯度

2) 降低模板量

3) 降低荧光阈值

四、单峰、峰不尖锐

可能原因

与试剂成分有关；或存在大小相近的非特异性扩增。

解决方案

1) 温度跨度不高于7度，视为可用结果

2) 进行高浓度琼脂糖电泳，确认是否为单一条带。

五、单峰，Tm低于80度

可能原因

只有引物二聚体，无目的条带；或扩增片段过短。

解决方案

1) 检查是否加入模板

2) 进行琼脂糖电泳检测，确定条带大小是否正确

六、双峰，较低峰Tm在80度之前

可能原因

由于模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成引物二聚体。

解决方案

1) 适当提高退火温度

2) 提高模板量，降低引物浓度

3) 重新设计引物。

七、qPCR注意事项

·提高样品纯度，尽量减少样品之间的交叉污染。

·每个样品至少要做3个平行孔，以防在 后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

·MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好融解后放 在4℃；配置体系时在冰上操作；减少加样误差，每管或每孔都要换新枪头，不要连续用同一个枪头加样；所有成分加完后，离心去除气泡。

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Elabscience生物素标记试剂盒有哪些常见问题？如何解决？

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Elabscience生物素标记试剂盒有哪些常见问题？如何解决？

Elabscience生物素标记试剂盒提供了标记所需的全部试剂，能简单有效地对含有伯氨基（-NH2）分子的蛋白标记。那么你知道Elabscience生物素标记试剂盒有哪些常见问题吗？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、蛋白上wan全没有标记上生物素

1. 不恰当的操作，如生物素和蛋白未wan全混匀，蛋白中的含有过量的铵离子或者氨基成分，或者其他误操作。解决方法：设置阳性对照。

2. 生物素保存不当。解决方法：未标记之前，生物素中不可混入水分，取生物素时，平衡至室温约 5~10 min 后再开封。

3. 超滤管使用不当。解决方法：超滤完后，滤芯中液体较少，不要使用移液器直接吸取超滤管芯中的样品，应倒置后离心出样品。

4. 因离心机的差异，超滤时转速过高。解决方法：离心机转速为12000×g，非 12000rpm。

5. 超滤管漏液。解决方法：超滤管芯不要装过多液体导致溢漏。

二、较低的蛋白回收率

1. 标记过程中蛋白发生聚集沉淀。解决方法：添加 1M Tris 及时终止反应。

2. 超滤浓缩时蛋白浓度过大。解决方法：一支超滤管芯不要装入过多的蛋白，如 1 mg以上的蛋白。

3. 蛋白在标记缓冲液中溶解度不高。解决方法：换用其他标记蛋白试剂盒。

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免疫荧光实验的常见问题与注意事项

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免疫荧光实验的常见问题与注意事项

　　免疫荧光技术是一种建立在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础之上的先进技术。它基于抗原抗体反应的原理，首先将已知的抗原或抗体标记上荧光标签，然后使用这些荧光标记的抗体（或抗原）作为探针，用来探查细胞或组织中的相应抗原（或抗体）。那么你知道免疫荧光实验的常见问题与注意事项吗？让我们一起来看看吧！
　　一、注意事项：
　　为进行免疫荧光实验，我们需要准备细胞样本，而这些细胞样本有多种来源和处理方式。
　　一种是可以使用直接附着在盖玻片上的贴壁细胞。这类细胞在培养时，只需将盖玻片放入培养皿中，细胞便会在上面黏附并生长。这种方法特别适用于附着性较好的细胞类型，因为可以减少后续漂洗步骤时细胞脱落的风险。
　　另一种选择是使用离心分离后的悬浮细胞，这些细胞需要制备成涂片。此外，还可以从体内组织中获得细胞悬液，然后通过离心制备成涂片，这适用于特定实验需求。
　　在选择细胞准备方式时，需根据具体实验的要求和所使用的细胞类型来决定，以确保最终获得可靠的免疫荧光实验结果。
　　二、常见问题：
　　1、无/弱染色烤片温度过高，推荐56℃-60℃1-2h；一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。
　　2、非特异性背景染色是否灭活内源性过氧化物酶；孵育过程中干片；抗原热修复过度。
　　3、染色过深一抗浓度过高；染色试浓度过高或孵育时间过长；染色剂浓度过高或孵育时间过长。
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Elabscience Caspase 1活性检测试剂盒的常见问题有什么？如何解决？

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Elabscience Caspase 1活性检测试剂盒的常见问题有什么？如何解决？

Elabscience自主研发的Caspase 1活性检测试剂盒采用分光光度法，可用于检测细胞、组织裂解液或其它样本的caspase 1 活性。那么你知道Elabscience Caspase 1活性检测试剂盒的常见问题有什么吗？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、OD405 值偏低或无信号

1. 焦亡现象不明显或者细胞处于焦亡晚期，细胞破碎死亡。解决方法：焦亡现象不明显以及诱导过度至细胞死亡均无法有效检测到 caspase 1的活化，可设置梯度诱导浓度和诱导时间选择最佳的诱导方案。

2. 细胞诱导时的密度太大。解决方法：降低诱导时细胞的密度，摸索最佳诱导密度，推荐诱导浓密为5~10×105 /mL。

3. 细胞数目太少，Cell Lysis Buffer太多。解决方法：增加细胞的数量，每100万细胞加入50~100 µL Cell Lysis Buffer。

4. 检测总蛋白量较低。解决方法：使用Bradford 法测浓度，提高蛋白检测的总量，可以进行预实验检测，检测总蛋白不低于50ug。

5. 温度较高，Cell Lysis Buffer中的DTT失活，Caspase 酶失活。解决方法：Cell Lysis Buffer 和细胞裂解过程在冰上进行，每 10 分钟进行涡旋混匀一次，充分保证酶活。

6. 细胞沉淀的保存条件不佳，导致细胞降解，Caspase酶失活。解决方法：收集细胞沉淀后立即放入-20℃（1个月）或者-80℃（2个月）保存备用，规定时间内进行检测。

7. 37℃孵育时间过长。解决方法：适当延长 37℃孵育时间，建议最佳孵育时间为1~2小时内，随着时间延长，control 组的背景数值会逐渐增大，导致结果偏低。

二、OD405值偏高

1. 细胞处理试剂或者药物有颜色，且在405nm 波长有吸收峰。解决方法：增加细胞离心洗涤的次数，设置细胞处理试剂的空白对照，最终实验结果减去药物试剂的影响。

2. 检测样本中有较多气泡。解决方法：排除气泡后再检测。

3. 使用回收的96孔板中有杂质附着，导致结果偏高。解决方法：建议使用新的一次性 96 孔板。

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Elabscience一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的常见问题及解决方法有什么

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Elabscience一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的常见问题及解决方法有什么

Elabscience® One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit 是一款灵敏度高且能快速简便的检测细胞凋亡的产品。本试剂盒适用于组织样本(石蜡切片、冰冻切片)和细胞样本(细胞涂片、细胞爬片)的原位凋亡检测，检测结果可通过荧光显微镜直接观察。那么你知道Elabscience一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的常见问题有什么吗？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、非特异性染色

原因：

1. TdT酶的浓度过高。

2. TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。

3. 光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂）。

4. 在固定组织时样本 DNA 已断裂（内源核酸酶的作用）。

5. 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液。

6. 固定后某些核酸酶活性依然较高导致 DNA 断裂。

解决方法：

1. 用TdT Equilibration Buffer以1:2~1:10稀释。

2. 注意控制反应时间，并 确保TdT酶反应液能很好地覆盖样品。

3. 尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂。

4. 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定。

5. 采用推荐的固定液。

6. 用含有dUTP和dAPT的溶液封闭。

二、标记率低

原因：

1. 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失）。

2. 固定时间过长，导致交联程度过高。

3. 石蜡切片脱蜡不充分。

4. 荧光淬灭。

5. 通透条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低。

解决方法：

1. 用溶于 PBS pH7.4中的4%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。

2. 减少固定时间，或用溶于PBS pH7.4的2%多聚甲醛固定。

3. 延长脱蜡时间；更换新的脱蜡液。

4. 注意避光操作。

5. 增加通透时间；优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间。

三、组织样本脱落

原因：

组织样本被酶从载玻片上消化下来。

解决方法：

降低蛋白酶K的处理时间。

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Elabscience一步法TUNEL流式凋亡检测试剂盒的常见问题及解决方法

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Elabscience一步法TUNEL流式凋亡检测试剂盒的常见问题及解决方法

Elabscience一步法TUNEL流式凋亡检测试剂盒是一款灵敏度高且能快速简便地检测细胞凋亡的产品。该试剂盒可通过流式细胞仪来进行悬浮细胞、贴壁细胞的流式凋亡检测。那么你知道Elabscience一步法TUNEL流式凋亡检测试剂盒的常见问题及解决方法吗？让我们一起来看看吧！

一、细胞碎片较多

原因：

1. 固定不充分，破膜导致细胞破碎。

2. 破膜时间过久，破膜温度较高。

解决方法：

1. 适当延长固定的时间，充分固定细胞后再破膜。

2. 破膜时间应控制在 10 min，最长不超过 15 min，保证在冰上破膜。

二、未检测到凋亡细胞群

原因：

1. 细胞诱导凋亡失败。

2. 细胞数目较多，细胞透膜不彻di。

3. 用含有EDTA 等螯合剂的试剂洗涤细胞，导致TdT酶失效。

解决方法：

1. 设置不同的浓度梯度和诱导时间，找到合适的诱导条件。

2. 适当调整细胞数量，或增加Permeabilization Buffer 的剂量，合理充分破膜。

3. 使用不含螯合剂的洗涤液。

三、保存

-20°C 保存，保质期一年。Labeling Solution 需避光保存，Labeling Solution、Fixation Buffer、Permeabilization Buffer 需避免反复多次冻融，建议分装保存。

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细胞培养的常见问题及解决方法

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细胞培养的常见问题及解决方法

　　你知道细胞培养的常见问题及解决方法吗？让我们一起来看看吧！
　　一、培养细胞不贴壁
　　原因：
　　1.胰蛋白酶消化过度；
　　2.支原体污染；
　　解决方法：
　　1.缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度；
　　2.分离培养物，检测支原体。清洁支架或培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物；
　　二、悬浮细胞成簇
　　原因：
　　1.培养液中含钙,镁离子；
　　2.支原体污染；
　　3.蛋白酶过度消化使得细胞裂解；
　　解决方法：
　　1.用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻巧吹吸
　　2.细胞获得单细胞悬液；
　　3.分离培养物，检测支原体；
　　三、培养细胞生长缓慢
　　原因：
　　1.由于更换不同培养液或血清；
　　2.培养液中一些细胞生长必须成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏；
　　3.培养物中有少量细菌或真菌污染；
　　解决方法：
　　1.比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验，让细胞逐渐适应新培养液；
　　2.换入新鲜配置培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子；
　　3.用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物；
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免疫细胞（ICC）实验常见问题有哪些？

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免疫细胞（ICC）实验常见问题有哪些？

免疫细胞化学 (ICC) 是一种使用荧光抗体或染料来检测细胞内靶抗原的技术。那么免疫细胞（ICC）实验常见问题有哪些？让我们一起来看看吧！

一、荧光信号弱

1. 样品质量

选用新鲜制备的样本以及适当的保持条件。

2. 靶标丰度低

适当提高一抗浓度。

选择荧光强度更强的二抗。

3. 固定方法不当

甲醛和蛋白的氨基通过共价键结合，可能会遮盖抗原表位，导致靶表位信号减弱。建议调整抗原修复方法或固定方法。

多聚甲醛会与GFP荧光蛋白发生醛化反应，导致信号减弱。

检测膜蛋白一般不建议使用甲醇或丙酮固定，有机溶剂能够破坏膜结构。

4. 透化方法不当

检查靶标蛋白表达位置，胞内蛋白需要透化处理。

膜蛋白需要考虑所检测靶表位位于膜内还是膜外，膜外则不需要透化。

5. 信号放大不够

如果检测靶点是低丰度蛋白．信号弱可能是由于信号放大不足导致的，可以使用Invitrogen SuperBoost 酪胺信号放大技术，进一步增强信号，实现低丰度，难以检测蛋白的检测。

二、背景太高

1. 封闭不足

（1）选用二抗种属来源的血清封闭。

（2）选用链霉亲和素/生物素系统，需要用链霉亲和素封闭内源的生物链酶。

（3）选用HRP系统，需要使用过氧化氢等商业化试剂盒去活化内源性HRP。

（4）选用AP系统，需要使用左旋咪唑等商业化试剂去活化内源性磷酸酶。

2. 一抗

一抗浓度过高，减少用量

3. 二抗

（1）设置无一抗对照，帮助确认背景是否来源二抗。

（2）二抗浓度过高，减少用量。

（3）抗体凝聚，使用二抗前离心去掉抗体凝聚物。

（4）使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗，信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。

4. 自发荧光

（1）设置自发荧光对照，确定是否自发荧光。

（2）固定剂如醛类和氨基共价结合导致的自发荧光，可用硼氢化na去除。

（3）增加固定剂的漂洗次数。

（4）避开背景高的波段，选用背景较低的波段检测。

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ELISA的常见问题有哪些？解决方法是什么？

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ELISA的常见问题有哪些？解决方法是什么？

酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。那么你知道ELISA的常见问题有哪些？解决方法是什么吗？让我们一起来看看吧！

一、高背景或阴性对照只偏高

原因：

1. 阴性对照孔被阳性对照货样品污染

2. 抗体非特异性结合

3. 酶结合物过浓

4. 孵育温度过高

解决方法：

1. 洗涤是，勿将洗液溢出孔外

2. 封闭液不合适，更换封闭液

3. 请检查酶结合物是否按说明书规定稀释

4. 检查孵育箱的温度是否正确、稳定

二、标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号

原因：

1. 样本中无检测物或检测无含量极低

2. 样本中其它物质影响/掩盖检测

3. 样本中检测物浓度过高，HOOK效应导致假低值

解决方法：

1. 设置内参，重新实验

2. 作适当稀释，降低其它物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率

3. 适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内

三、重复性较差

原因：

1. 微孔中有气泡

2. 试剂未混匀

3. 样本中有杂质或沉淀物

4. 微孔包被面被吸头划破

解决方法：

1. 用针尖挑破气泡

2. 确保充分混匀试剂

3. 使用前；离心

4. 加液是小心操作

四、假阳性反应

原因：

1. 洗涤不充分

2. 洗板机管道堵塞

3. 加结合物是，洒在微孔边缘

解决方法：

1. 使用前需检查洗板机是否正常工作

2. 需经常维护洗板机

3. 小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触

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流式细胞周期检测的常见问题有哪些？

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流式细胞周期检测的常见问题有哪些？

你知道流式细胞周期检测的常见问题有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、样本制备注意事项

1.根据不同的检测细胞调整合适的温度、湿度、酸碱度等培养环境，注意一定要无菌的环境培养。

2.培养细胞时，以对数期处理为宜，避免细胞量过少导致收集细胞量不足或者细胞量过多导致细胞开始大量死亡造成的实验误差。

3.流式检测细胞周期上机检测所需收集细胞量较多，收集细胞时尽量多收集一些

4.流式检测对细胞离心，重悬次数较多，注意动作轻缓，避免过多地损伤、弄破细胞。

5.本实验对细胞离心，重悬次数较多，注意动作轻缓，避免过多地损伤细胞。

6.细胞周期待测细胞尽量要获得单个细胞，避免DNA的降解。

7.样本最关键的就是减少碎片(EDTA/不可过度吹打/离心rpm)。PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解。PI质量及RNase所加量很重要，建议用商品化试剂。

8.污染脱氧核糖核酸酶会降解DNA，故玻璃器皿和试剂要干净灭菌。

9.染液等物质有一定毒性，注意防护。

二、流式检测时的注意事项

1.固定时必须预冷PBS重悬打入无水乙醇中，做到随加随混匀，避免细胞形成团块。

2.固定后细胞虽然可以保存较长时间后再上机检测，为避免不可控因素影响最好尽早上机检测。

3.进样速度：一般检测细胞浓度调整为2*10^5到2*10^6/ml，建议进样速度为低速。若峰形较宽、CV较大，可能就是进样速度太快。

4.仪器质控定期做，检查质控微球的CV值，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽。

5.通过电压脉冲信号的宽度、高度、面积等参数区别实体组织标本中的粘连细胞群体，zui大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果。

6.选择合适的细胞系，不同的细胞系由于细胞形态、直径等不同，会对结果的美观程度有一定的影响，笔者常用HeLa细胞系，峰形较细，周期各阶段明显区别，结果美观。

7.建议选择6孔板操作，细胞给药密度在40%左右，给药时间不一定要与蛋白印迹法给药时间一致。这是由于蛋白印迹法检测的是蛋白表达的变化，例如给药10小时，蛋白上可见明显变化趋势，但10小时收样时，孔内细胞已经明显观察到细胞漂浮凋亡，那对流式检测的结果会有很大的影响。流式细胞术收样时，尽量保证孔内细胞还未漂浮。

8.收样时，如果孔内已经有细胞漂浮，细胞上清悬浮液也要收集。建议选用胰酶消化，消化时间必须严格控制，及时终止消化，消化时间太久，容易对细胞造成损伤和死亡。

9.收集细胞时，离心机选用4℃，300-500g离心5分钟，小心吸去上清。加入0.3 mL预冷的PBS，将管内的细胞混匀后，再加入0.7 mL预冷的无水乙醇，4℃固定过夜。整个收样过程中，不要用枪头剧烈吹打细胞，一是会损伤细胞，二是造成细胞损失。

10.上机前，离心机选用4℃，300-500g离心5分钟，弃去上清。此时格外需要注意的是由于不同时期细胞的重量不一样，离心后细胞不是全部沉淀在管底，管壁上也会存在大量细胞，去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液，避光染色15分钟以上，上机测试前最好使用200目筛网过筛，以免细胞聚集堵塞机器管道。

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WB实验常见问题有哪些？如何解决？

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WB实验常见问题有哪些？如何解决？

Western Blot虽是实验室zui常用的蛋白分析技术，但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多，所以导致在实验过程中会遇到各式各样的问题，那么你知道WB实验常见问题有哪些呢？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、目标条带没有信号

原因分析：

1.样品中可能含有蛋白酶，使蛋白样品分解成小分子。

2.目标蛋白浓度过低（低于检测下线）。

3.转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿。

4.一抗的特异性不佳，导致一抗无法识别目标蛋白。

解决方法：

1.添加蛋白酶抑制剂。

2.加大上样量或提高目标蛋白浓度。

3.控制转膜时间并选择适合的转印膜。

4.选用高品质抗体。

二、图片背景过高，难以分辨条带

原因分析：

1.一抗浓度太高，导致抗体非特异性结合。

2.洗膜的时间和次数不够，导致其他蛋白没有清洗干净

3.封闭物用量不足。

4.封闭物使用不当。

解决方法：

1.降低一抗浓度。

2.提高洗脱时间和频率。

3.提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液wan全浸没转印膜。

4.检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。

三、 膜上出现黑点和黑斑

原因分析：

1.抗体与封闭试剂反应。

2.HRP偶联二 抗中有聚集体。

解决方法：

1.使用前过滤封闭试剂。

2.过滤二抗试剂，去除聚集体。

四、出现非特异性条带

原因分析：

1.一抗非特异性与蛋白结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。

2.目的蛋白有多个修饰位点，有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。

3.蛋白样品降解，蛋白酶将目标蛋白分解成若千个蛋白，而这些蛋白同样可以被一抗识别。

解决方法：

1.更换一抗。

2.更换一抗品种。

3.添加蛋白酶抑制剂。

五、条带粘连

条带粘连是不同孔目标条带连在一起，中间无间隔，如图所示。出现该现象的原因可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）

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流式细胞仪的常见问题有哪些？

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流式细胞仪的常见问题有哪些？

流式细胞仪(flow cytometry，FCM)作为一种强大的单细胞分析工具，可以对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。那么流式细胞仪的常见问题有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、抗体孵育时间过长会影响检测结果吗？

通常情况下，标记细胞表面抗原的荧光抗体需要在室温孵育20-30分钟。

对于一些状态较脆弱的细胞（例如从组织中分离、培养的免疫细胞），切勿过长时间孵育，同时建议使用染色缓冲液（Staining Buffer），其中主要成分为PBS，叠氮钠和胎牛血清，胎牛血清可以减少抗体的非特异性结合，叠氮钠可以维持细胞表面抗原的稳定性。

对于胞内或者核内标记抗体，可以在固定、破膜后适当延长孵育时间，或者破核膜同时孵育核内抗体。

二、样本不能及时上机检测，血样和组织样本的保存方法？

通常情况下建议样本处理至表面抗体孵育结束，再用1%多聚甲醛重悬固定4℃保存至下一步，或者4%多聚甲醛固定10分钟后洗去，用StainingBuffer重悬，4℃保存至下一步，48小时内上机检测。如不具备前处理条件，外周血可以使用流式专用保存管存放，组织样本剪成小块后用保存液存放，建议不错过3天进行前处理和上机检测。

三、流式细胞仪测细胞周期，各个周期峰分不开，只有一个宽峰是为什么？

①如果是持续出现这种情况，说明仪器的PI检测通道CV值过高，管路需要深度清洁或者更换。

②前处理过程中出现的问题，如：乙醇固定条件（浓度、时间）的改变造成通透不wan全、RNA没有处理wan全、通道CV较差同时受到异倍体干扰等。

③如果个别组出现此情况，可能是受到实验处理条件的影响，如：转染的荧光干扰、集中在周期区间的抑制、对细胞影响过大等。

四、钙离子（Ca2+）流式检测如何设置对照？

Ca2+检测通常使用Fluo-3、Fluo-4等荧光探针，这类探针通常会在活细胞内与钙离子结合发出荧光，进行相关成像或流式检测。因此钙离子检测会有静态检测和动态检测两种方法。

静态检测主要用于检测相对胞内浓度变化，需要设置空白对照、阴性对照、阳性对照，以相对的方式检测荧光值。

动态检测主要用于检测钙动员的情况，监测加入刺激剂后的Ca2+变化情况。通常用于检测一些免疫细胞，也可以用于分析不同淋巴细胞亚群的变化情况。

更多有关流式细胞仪的常见问题，请联系上海金畔生物科技有限公司：

qPCR曲线常见问题有哪些？如何解决？

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qPCR曲线常见问题有哪些？如何解决？

在 qPCR 实验过程中，经常会遇到异常扩增曲线和熔解曲线的困扰，那么qPCR曲线常见问题有哪些呢？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、扩增曲线相关问题

1.无扩增曲线

可能原因：

（1）没有打开荧光信号采集。检查程序设置，三步法扩增程序在 72℃ 延伸阶段采集信号，两步法扩增程序的信号采集设置在退火延伸步骤。

（2）引物降解。可通过 PAGE 电泳检验引物的完整性。

（3）模板浓度低。建议增加模板投入量或重新制备较高浓度模板。

2. 扩增曲线不光滑

可能原因：

（1）仪器长时间未校准，在检测中出现了波动，建议定期校准仪器；

（2）RNA 模板不纯，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 RNA 模板。

3. 扩增曲线平台期抖动

可能原因：仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。

4. 扩增曲线右下方下落呈倒扣状

可能的原因：模板浓度过高，基线终点值大于 CT 值，仪器默认起峰位置仍为基线期，将起峰位置往基线下拉，所以扩增曲线变成了倒扣的 S 形（左图）。可适当减小基线范围，手动调整基线终点值至 CT 值 -4，调整基线范围后，扩增曲线即恢复正常（右图）。

二、熔解曲线相关问题

1. 有扩增曲线无溶解曲线

可能原因：检查是否有设置熔解曲线步骤或熔解曲线信号采集是否打开。

2. 熔解曲线杂峰

（1）杂峰在主峰之前

可能的原因：杂峰在主峰之前，Tm 在 70～75℃ 范围内，一般是引物二聚体。引物二聚体是引物 3’ 端的部分碱基互补结合，在 Taq 酶的作用下，3’ 端延伸后得到的小分子量的双链 DNA 片段。可根据 NTC（无模板阴性对照）判断是否为引物二聚体。

解决方案：建议通过提高模板浓度、提高退火温度、降低引物浓度来改善。

（2）杂峰在主峰之后

可能的原因：非特异性扩增，可能由于引物特异性较差，或体系中有气溶胶污染（可结合 NTC 确定体系是否有污染）。建议先提高退火温度，可提高扩增特异性。如果提高退火温度对于特异性没有改善，建议更换特异性较高的引物。

更多有关qPCR曲线常见问题及解决方法，请联系上海金畔生物科技有限公司：

蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么？

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蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么？

在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，那么你知道蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、注意事项：

1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。

2、浓度不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。

3、选择合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。

5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。

8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。

二、常见问题：

1、通过 His 标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？

（1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

（3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。

2、镍柱使用中出现棕色的原因

（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心，并过0.22或者0.45的膜。

（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入 1-2mM DTT （上清样品处理要在冰浴中进行），还不行加尿素变性，使其在变形环境下。

（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。

3、纯化过程中蛋白出现了浑浊应如何处理？

（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂 DTT。

（2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。

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如何解决病毒转染实验的常见问题？

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如何解决病毒转染实验的常见问题？

病毒转染是指将外源病毒导入真核细胞的技术，用病毒将带有目的基因的载体整合到细胞的基因组中，以达到长期稳定表达目的基因的目的，那么你知道该如何解决病毒转染实验的常见问题吗？让我们一起来看看吧！

一、转染效率低

可能是由于病毒感染的细胞数量不足、浓度太低、转染时间过短、细胞质量差等原因导致。可以尝试增加病毒的浓度和转染时间，或者优化细胞培养条件来提高转染效率。

解决方法：优化病毒载体和转染剂的选择和使用方法，调整细胞的培养条件和密度，增加转染时间和浓度等操作方案。

二、细胞毒性

病毒转染过程中产生的细胞毒性会直接影响细胞的生长和稳定性，甚至影响实验结果。需要注意选择合适的病毒载体和转染剂，并对细胞状态和密度进行调整。

解决方法：针对病毒转染产生的细胞毒性，可采用补充营养物质、调节培养基pH值或温度、添加保护剂等方式进行缓解。

三、重复感染

在进行病毒转染时，避免病毒的重复感染，可对细胞进行预处理和检测，尤其是对病毒拓展因子表达的细胞系进行特别注意。

解决方法：加强实验前的准备工作，避免重复感染的发生。例如，对细胞进行必要的预处理和检测，及时更换新鲜培养基，使用消毒材料等。

四、非特异性效应

外源DNA或RNA转染后，可能会影响宿主基因表达和细胞功能，出现非特异性效应。需要对目标基因进行严格的鉴定和筛选，以确保实验结果的准确性和可靠性。

解决方法：通过对外源DNA或RNA转染后基因表达的分析鉴定，筛选出特异性效应较好的目标基因，并进行进一步的实验验证和数据分析。

更多有关病毒转染实验常见问题的解决方法，请联系上海金畔生物科技有限公司：

细胞实验的常见问题有哪些？如何解决呢？

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细胞实验的常见问题有哪些？如何解决呢？

细胞培养做为生物学研究最基础的技术之一，可以说是渗透科研界的方方面面。那么细胞实验中的常见问题有哪些？应该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、如何选用细胞系培养基？

优先根据细胞来源公司提供的培养条件，。一般建议不要随意更换培养基种类。细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用与原先提供的培养条件不同的培养基，可能造成细胞形态发生变化或无法存活，以及细胞的表型功能丢失。

二、细胞发生微生物污染时，应如何处理？

直接丢弃或更换，将未受污染的细胞转移至其它培养箱，并用消毒剂消毒培养器皿和超净台以及二氧化碳培养箱。如发生真菌霉菌污染，需用紫外灯照射整个细胞间，从而消除可能产生的孢子。同时排除使用试剂的污染，包括培养基和血清，可以空培试验。

三、为何培养基用一段时间后，颜色偏紫？

培养基随着多次开盖会使培养液 CO2 逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性从而变紫，尤其是剩余的培养基越少越容易变紫。可将培养瓶瓶盖旋松放入二氧化碳培养箱校正溶液 PH 值，过一段时间就会变回正常。变紫的培养基是可以继续使用的，培养细胞时在培养箱会自动恢复颜色。

四、细胞培养液变黄变浑，如何处理？

细胞培养液变黄多半是细胞密度过大，细胞增殖速度过快，产生大量酸性代谢废物，导致细胞营养不足。而培养液变浑多半是发生了细菌污染。出现这种情况应立即进行消化传代处理。

五、血清中出现的沉淀是什么，有影响吗？

① 纤维蛋白，是经常出现的较大沉淀物，可达到 1～2 mm，用肉眼可观察到；

② 胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质，是血清出现沉淀物的常见原因；

③ 磷酸钙，也是一种常见沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在 37 ℃ 培养时会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。

这些沉淀对细胞的生长是没有影响的，如想去除沉淀，尽量采用离心方法，不建议使用过滤方法，因为会堵塞滤膜而且会造成污染的风险。

六、细胞支原体污染如何处理？

支原体污染是比较难去除的，特别容易复发，一般建议直接更换新的细胞，如特别精贵或重要的细胞可尝试使用四环素、大环内酯类抗生素（泰乐霉素）、喹诺酮类抗生素。

更多有关细胞实验中的常见问题及其解决方法，请联系上海金畔生物科技有限公司：

血清使用常见问题，如何处理？

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血清使用常见问题，如何处理？

购买血清后，在使用的过程中，会遇到这样那样的问题，如何处理呢？让我们一起来看看吧！

一、血清保存的最好方法？

建议血清最好保存在-20℃保存。若一次使用不完一瓶，建议无菌分装于适当的灭菌容器内冷冻备用。

二、如何解冻血清，才能保证其质量不会受损？

建议将血清从冷冻箱取出后，置于2℃～8℃冰箱中解冻，然后在室温下全融，解冻过程中必须规则地摇晃均匀。

三、为什么血清在解冻后会出现絮状沉淀？应该怎样处理？

血清中絮状沉淀产生的原因有很多，其中最pu遍的还是由于血清中脂蛋白的变性所致，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）。在血清解冻后，也会存在于血清中，这也是造成沉淀的主要原因，但这些絮状沉淀并不影响血清本身的质量。欲去除沉淀，可采取自然沉降法或者将血清分装于无菌离心管中，2000～3000rpm离心5min。一般不建议用过滤的方法去除絮状沉淀，因为沉淀会阻塞滤膜，造成过滤困难或无法过滤。

四、为什么要热灭活血清？有必要热灭活吗？

加热可以灭活血清中的补体系统，使补体去活化。通常未灭活的补体能够刺激平滑肌收缩、肥大细胞和血小板组胺的释放、激活淋巴细胞和巨噬细胞，同时还能够参与溶解细胞的过程。

诸多研究表明大多数细胞的培养无须进行血清的热灭活；而在免疫学研究和ES细胞、昆虫细胞、平滑肌细胞的培养过程中，推荐使用热灭活血清。实验显示，经正确热灭活处理的血清，对细胞的生长只有微小的促进或wan全没有促进作用，而通常因为高温处理影响了血清的质量，造成细胞生长速率降低。并且热处理过的血清，沉淀物明显增多，倒置显微镜下观察呈“小黑点”，往往会使研究者误以为是血清受到了污染，而把血清放于37℃中，沉淀物又会更增多，有会使研究者误认为是微生物的分裂增殖。因此我们建议若非必须，可以不进行热处理，既节省时间又确保质量。

五、如何避免沉淀物的产生？

建议您在血清使用的过程中，采用正确的解冻方法（冷冻→4℃→室温），若血清解冻时改变的温度太大（如冷冻→37℃）非常容易产生沉淀物。温度过高、时间过久、摇晃不均匀等，都会造成沉淀增多，建议如非必要无须对血清进行灭活；若必须热灭活，应严格遵守56℃，30min的原则，并随时摇晃均匀。

更多有关血清使用常见问题的介绍，请联系胎牛血清供应商——上海金畔生物科技有限公司：

血清使用的常见问题回答

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血清使用的常见问题回答

1.血清中出现沉淀或絮状物的原因？

（1）2-8℃长时间储存；

（2）解冻过程中未混匀；

（3）γ-辐照：不会损害血清的理化特性或细胞培养性能；

（4）反复冻融：使血清脂蛋白发生变性造成浑浊；

（5）血清中残留的纤维蛋白原：残留的纤维蛋白原在解冻后会转化为纤维蛋白，过量的纤维蛋白在血清中表现为可见的絮状物质。

2.如何去除血清中的沉淀或絮状物？

使用400g离心，不建议直接过滤血清以去除絮状物质，因为过滤器可能会堵塞或者截留重要的蛋白质。

3.如何检测血清是否被污染？

将1 mL待测血清直接倒在细菌琼脂平板上，在37℃培养之后观察菌落的生长情况。在油镜（放大1000倍）下观察革兰氏染色，以确定是否受到污染。不建议用37℃孵育的血清直接检测无菌性，因为在37℃孵育之后，血清中的磷酸钙沉淀物会增加。

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PEI线性转染试剂特点及常见问题

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PEI线性转染试剂特点及常见问题

一、PEI线性转染试剂

PEI又称为线性化聚乙烯亚胺，是人工合成的含有高密度正电荷的有机大分子阳离子聚合物。PEI与DNA通过正负电荷的相互吸引形成复合物，是较为有效的聚阳离子型基因载体，转染效率高。PEI转染试剂可以方便地进行化学修饰，并且不会像脂质体一样破坏细胞结构，所以相对毒性较低。

二、PEI Max转染试剂(24765-1)特点

·转染效率高，细胞毒性低；

·蛋白表达量高；

·节约成本：PEI至少能够降低40%的转染试剂总成本；

·适用于HEK293等真核细胞的转染；

·适用于贴壁细胞和悬浮细胞的转染；

·适用于有血清和无血清的转染条件；

·无机试剂，无动物源成分；

·产品稳定，质控严格；

·工艺流程适用范围广，容易优化，适合小规模培养板、培养瓶到大规模的生物反应器。

三、PEI转染试剂性能

图1 转染PEI后的抗体表达

500mL HEK293细胞(A、C、E)和CHO细胞(B、D、F)细胞培养物转染LPEI、PEI Max和PEI proTM。采用蛋白-A HPLC法检测单克隆抗体曲妥珠单抗(A、B)、Palivizumab单抗(C和D)和B72-3(E和F)的滴度，与LPEI(PEI 25K)相比，当使用PEI Max和PEI proTM时，三种抗体的表达量都较高，但使用PEI Max试剂转染能使所有抗体都有最高表达。由此可见，PEI Max转染试剂(MW 40000)具有更高的转染效率。

四、转染中的常见问题

1.转染效率低

原因：(1)细胞活力：使用活力好传代小于15代的细胞。

(2)细胞接种密度高/低：适当降低/增加接种密度。

  (3)PEI/DNA比率不合适：进行不同基因转染时应对PEI和DNA的比例进行优化，以达到最适比例。

(4)质粒片段较大：可根据实际实验需要调整，如适当增加转染质粒总量等。

  (5)混合方式不当：质粒DNA和PEI溶液混合时避免涡旋。同时要注意PEI加入 DNA溶液中的顺序。

2.细胞毒性高

原因：(1)转染液孵育时间过长：过长时间 PEI/DNA 复合体会导致细胞毒性。

(2)细胞接种密度低：适当增加接种密度。

(3)PEI/DNA比例高：优化合适的PEI和DNA的比例。

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