质粒构建实验影响因素有哪些？

质粒构建是指选定的目的外源基因（DNA）先要经过PCR扩增。随后用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA片段，再使用DNA连接酶将切割后的载体与DNA片段连接，转入宿主细胞。最后经过筛选鉴定出正确的重组克隆质粒，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。那么质粒构建实验影响因素有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、载体的选择

在选择克隆载体时应注意以下几点：

①具有自主复制能力，拷贝数高；

②携带易于筛选的选择标记；

③含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入；

④载体应尽可能小（＜15kb），便于导入细胞和进行繁殖；

⑤使用安全。克隆载体应只存在于有限范围的宿主内，在宿主体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。

二、引物设计注意事项

在构建质粒时，设计引物时应该考虑引物长度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素，并避免引物间出现配对突变或二次结构等情况。

前向引物：5’端 — 上游克隆载体末端同源序列 + 基因正向扩增引物 –3’端

反向引物：3’端 — 基因反向扩增引物 + 下游克隆载体末端同源序列 –5’端

运用PCR扩增目的基因的过程中，引物设计注意事项：

① 引物长度最好在18-30bp左右，常用的长度是 20-22bp；

②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，相差最好不要超过 5°C；

③GC 的含量标准通常为 40%-60% 或45-55%；

④引物自身不应含有连续超过4个的互补的碱基，避免形成发卡结构或形成引物二聚体；

⑤引物的3’端要避免出现连续重复的碱基，如 GGG 或 CCC ，这会导致错配的发生，最后一个碱基最好是 G 或 C；

⑥在引物的 5’端添加酶切位点时（在不影响扩增的特异性的前提下），根据酶切位点序列，需要添加不同种类和数量的保护碱基，通常多加3个碱基即可满足保护酶切位点的需求；

⑦上下游引物最好加入不同的酶切位点，相同的酶切位点可能导致目的基因片段出现倒置连接现象，影响基因序列的正常表达。

三、酶切位点的选择

选择合适的剪切酶和连接酶对于质粒构建至关重要。剪切酶的选择应该考虑酶切位点的位置、酶的反应条件等因素。连接酶的选择应该根据所用的质粒载体和目的基因的大小来确定。

①选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。

②一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：

目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）。

③实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。

④尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。

⑤两个酶切点至少隔上3个碱基。

⑥两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

⑦最好使用酶切效率高的酶。

⑧最好使用双酶切有共同buffer的酶。

⑨在操作酶切连接的步骤时也要定性定量，保证酶活性充足。

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影响荧光原位杂交实验的因素有哪些？

荧光原位杂交是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是 20 世纪 80 年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。那么影响荧光原位杂交实验的因素有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、固定液的选择及固定时间

①石蜡组织建议用10%中性缓冲福尔马林固定12～48h，其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。

②组织标本离体后应尽快固定，较大标本切开固定。如样本固定不及时，荧光信号会减弱。（尤其环境温度较高时更应及时固定）

③固定液体积应不少于标本体积的10倍，否则固定不充分，容易出现无信号或者信号很弱的现象。

④为了保证信号的准确性，蜡块最好在2年内进行检测，已经切好的切片在6周内检测最佳。

二、组织切片和载玻片的选择

组织切片4～5μm厚，过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响，切片过厚将导致杂交不充分，最终信号点发生重叠，影响计数。而且切片应完整，质量良好，否则会在预处理时掉片。

载玻片的选择建议使用防脱载玻片，有条件的实验室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片，可有效防止脱片现象的发生。

三、切片的预处理

切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。

①当组织处理不规范、切片过厚或烤片不足时，在煮沸过程中容易掉片，建议烤片温度在56℃过夜。煮沸过程中要严格控制实验温度和时间。

②酶消化是FISH实验的关键步骤之一，如果对组织不熟悉，可以先消化推荐的反应时间，然后复染DAPI在荧光显微镜下观察，在DAPI通道下，以细胞既无空洞(消化过度)，亦无明显的云雾状(消化不足)为最佳，同时可切换观察红绿通道，以红绿通道无明显的背景为佳，如果背景较高，可适当延长消化时间。

③对于陈旧的石蜡组织切片，要适当延长消化时间，否则会出现大量的自发荧光。

四、变性和杂交

变性和杂交是本实验最关键的步骤，变性的时间和温度是杂交成功是否的关键，变性和退火温度对荧光信号影响较大，变性和退火温度过低会导致杂交效率变低，使荧光信号变弱，变性和退火温度过高易出现高背景。

为保证变性期间温度的稳定，建议采用专业的原位杂交仪进行变性和杂交步骤，不仅能够减少实验的繁琐性，而且更有利于实验条件的控制，比如时间、温度和避光条件等。

为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失和防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。

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影响细胞转染效率的因素有哪些？

随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，细胞转染已经成为研究真核细胞基因功能的常规工具。常用于研究基因功能、基因表达调控、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用非常广泛。既然细胞转染如此重要，那影响细胞转染效率的因素有哪些？让我们一起来看看吧！

一、转染试剂

不同细胞系转染效率通常不同，因此在转染实验前需要根据细胞特性选择合适的转染试剂。可以通过已发表文献和转染试剂提供的已成功转染的细胞株来进行选择。

二、细胞状态

转染前细胞活力和总体健康状况是转染产生变异性的重要来源。一般建议在转染前至少24小时进行传代培养，以确保细胞在传代后处于转染的最佳生理条件，细胞活力大于 90%。最shi合转染的细胞是复苏经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。为确保转染的重复性，一般选择低细胞代次（<30，能确保基因型不变）。如果发现同一株细胞转染效率降低，可以尝试重新复苏细胞以恢复最佳结果。此外，污染会严重影响转染结果。

三、汇合度

转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此要根据具体的细胞类型、应用和转染技术，来优化确定相应的最佳密度。如使用阳离子脂质体转染时，贴壁细胞一般达到 70%-90% 的汇合度，悬浮细胞达到 5 × 105 至 2 × 106 个细胞/mL 的密度，即可获得良好的结果。但不同的转染试剂，针对不同细胞系要求转染时的最适细胞密度各不相同，因此使用新的细胞系或者新的转染试剂时，应进行实验优化并建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。不同实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。

四、培养基

不同的细胞或细胞类型都有非常特定的培养基、血清、补充剂要求，选择最shi合细胞类型的培养基和转染方法在转染实验中起着非常重要的作用。一些细胞系和原代细胞可能需要特殊的包被材料（如多聚赖氨酸、胶原蛋白、纤连蛋白等）以附着于培养板并获得最佳的转染结果。

五、血清

一般培养基中存在血清可增强 DNA 转染。但使用阳离子脂质体转染时，一些血清蛋白会干扰复合物的形成，因此应在无血清条件下制备DNA-脂质体复合物。当使用 RNA 转染细胞时，建议在无血清条件下转染，以避免潜在的RNase污染。

六、抗生素

一般用于瞬时转染的培养基中可含抗生素。不过，由于阳离子脂质体试剂可增加细胞通透性，因此也可能增加递送到细胞内的抗生素量，从而导致细胞毒性以及较低的转染效率。因此不建议在转染培养基中加入抗生素。可在转染前铺板细胞时，使用无抗生素的培养基。

对于稳定转染，不应在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是 Gibco Geneticin 选择性抗生素的竞争性抑制剂。在构建稳定的细胞系时，在转染程序后预留 48-72 小时供细胞表达抗性基因，之后再加入选择性抗生素。

七、转染分子类型

质粒 DNA 是最chang用的转染载体。质粒 DNA 的拓扑结构（线性或超螺旋）和大小会影响转染的效率，超螺旋质粒 DNA 瞬时转染的效率zui高。在稳定转染中，相对于超螺旋 DNA，虽然使用线性 DNA 会导致细胞的 DNA 摄取量较低，但 DNA 整合到宿主基因组中的效果更优。虽然寡核苷酸、RNA、siRNA 和蛋白质等其他大分子也可以转染到细胞中，但在使用这些大分子时，需要优化转染条件。

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