常用的基因沉默技术有哪些？

基因沉默主要指基因表达的抑制和沉默现象。在生物体内，基因的表达受到严格调控，而基因沉默就是一种重要的基因表达调控方式。根据作用方式的不同，基因沉默可分为自然发生的基因沉默和人为操作的基因沉默。自然发生的基因沉默可通过多种因素实现，如DNA甲基化、异染色质形成、转录后基因沉默（RNAi）等。而人为操作的基因沉默则可以通过基因敲除、转录因子抑制、表观遗传修饰等方法实现。那么，常用的基因沉默技术有哪些？一起来学习一下吧！

RNA干扰（RNAi）：RNAi技术利用双链RNA（dsRNA）引发特异性mRNA的降解，从而降低或关闭目标基因的表达。RNAi技术具有高效、特异性强、操作简单等优点，已成为研究基因功能和药物筛选的重要工具。然而，该技术也存在一定的脱靶效应和细胞毒性等问题。
化学沉默：化学沉默是指通过特定的化学抑制剂或药物作用于细胞，干扰基因的表达或转录过程，从而实现基因沉默。常用的化学沉默药物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂等。这类方法的优点是可以通过口服或注射给药，直接作用于患者体液或组织，但对于作用机制和药物剂量要求较高。
基因敲除：基因敲除技术通过同源重组或CRISPR-Cas9等手段，将目标基因进行部分或wan全敲除。该技术具有较高的特异性和可操作性，但需要设计特异性的核酸酶，且存在一定的细胞毒性风险。
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细胞铺板不匀的解决方法有哪些？

细胞接种铺板作为体外药理实验中最基本的技能，是实验成败的关键因素。铺板不匀又是科研实验中通往成功道路的一大障碍，细胞聚集导致的接触抑制现象使实验数据的可信度大打折扣。本片文章将会介绍细胞铺板不匀的解决方法有哪些？一起来跟小编涨知识吧！

对于96孔板，每孔通常加入100μL细胞悬液。加样方式为倾斜枪头，从孔的左边靠近底部缓慢加入（加样过快同样容易导致细胞聚集）。笔者建议，每加完半拉板子时，把细胞重新混匀，继续加样。加样结束后，镜下观察如有局部不均匀现象，可以采取敲击法，具体操作如下：将板子置于台面上，左手持住板子的左边，右手轻轻敲击板子的右边缘(5-8次)，力度太强或次数太多会反而更易导致细胞聚集。将板子顺时针旋转，依次敲击剩余三个边（据说逆时针效果不好），静置约5-10分钟后，放入37℃培养箱。

对于6孔板、12孔板或24孔板，为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象。通常每孔首先滴加少量培基，轻轻晃动浸润整个孔底以保证板子的孔底都是湿润的，这样加液后细胞悬液会平铺在整个孔底，可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象，细胞分散会较均匀。注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下（5-10分钟）。镜下观察细胞均匀度，如不均匀可采用以下8字法、十字法及震荡法等方法进行细胞均匀度处理。具体操作如下：

 方法一(8字法)：这种方法也是大家最常见的细胞摇匀方法。横向8字摇匀法参考下图，摇动次数根据镜下观察和个人力度具体分析（参考：保证液体不被晃动出去，8字晃动5次理论上就可以基本晃匀）。摇匀结束，切忌在镜下移动观察视野太久，以免伴随着轻微的移动，细胞又往中间聚集。

方法二(十字法): 细胞铺完板后，在水平方向上，上下左右四个方向进行移动，呈十字形状，重复5-6次。有些同学觉得十字法摇匀效果并不好，方法关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的移动（也有同学建议可以在培养箱中摇匀）。另外，同样不建议放到镜下长时间去观察。

方法三(十字类似法)：细胞铺完板后，放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向5-6次。其他具体操作同十字法。

方法四(震荡法)：细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。（个人不太推荐这种方法，板子接触振荡器后增加了染菌的风险，而且转速的调节和时间的掌握比较困难）。
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细胞因子检测的常见免疫学技术有哪些？

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质粒纯化需要注意的要点有哪些呢?

质粒是小的环状超螺旋双链 DNA，在宿主细胞内独立于染色体外自主复制并稳定遗传，可通过基因工程改造接入外源 DNA 作为基因载体，转入宿主细胞。如今，质粒已成为生物制药领域中最重要的工具之一，可用于克隆，扩增和表达目的蛋白；也可用于病毒载体和 mRNA 的生产等领域。质粒纯化是大多数分子生物学实验室的常用技术。虽然标准的碱裂解方法已经很成熟，但仍然可能出现令人惊讶的问题。那么，你知道质粒纯化需要注意的要点有哪些呢?一起来探究一下吧！
忽略质粒的拷贝数
同一大肠杆菌母株的质粒产量可能因多种因素而有很大差异。然而，质粒的复制起点将发挥重要作用，因为它将决定每个大肠杆菌细胞的质粒拷贝数  。因此，根据质粒的拷贝数，可能需要扩大质粒制备规模或进行多次质粒制备，以获得足够的质粒DNA供下游应用使用。
忘记在培养物中添加抗生素
如果忘记在培养物中添加抗生素或添加太少，则可能导致质粒丢失。确保仔细检查培养物中抗生素的浓度。
忽略透气重要性
大肠杆菌培养物通常在瓶中生长，需要适当的通气才能实现最佳生长。通常需要以 200-250rpm的速度摇动培养物。此外，考虑通过最小培养物与空气体积比约为 1:5 来增加培养物通气，使用棉塞或透氧膜等确保培养物获得足够的通气。
过量培养
另一种情况是越多并不是越好，如果培养生长时间过长会导致基因组DNA污染。最好在接种后约 12-18 小时处理细胞。
测量OD600
OD600是估算培养物密度的好方法，以便您知道何时处理细胞。由于高光密度无法测量，因此取一份培养物，稀释十倍并使用标准分光光度计进行测量。培养物已准备好以0.2-0.35的OD600处理十倍稀释的培养物。
不要超出负载
许多质粒制备试剂盒都附带有关培养条件的建议。请仔细遵循这些步骤，以确保裂解纯化柱不会过载。添加过多的培养物肯定会降低裂解物的质量、堵塞纯化柱并降低纯化性能。
操作要清柔
正确纯化质粒的关键之一是将基因组DNA与质粒DNA分离。可以通过移液或涡旋将细菌沉淀重悬于P1缓冲液中。然而，在裂解过程中不能过度混合，因为您可能会剪切基因组DNA，而基因组DNA会与柱基质结合并污染您的质粒。
忽略裂解时间
有些人可能认为裂解时间越长越好，然而大肠杆菌的碱裂解时间过长会产生大量非质粒碎片。此外，不同菌株的大肠杆菌对碱裂解的敏感性也不同。最重要的是，裂解时间过长可能会导致质粒 DNA 变性，从而导致制备质量差。
wan全中和裂解物
添加中和溶液并与裂解液混合后，不要立即进行下一步！中和不wan全可能导致制备质量差。确保多次翻转试管以确保裂解物wan全中和。即使观察到大的蓬松沉淀物，也需要多一点时间以确保溶液wan全混合。
防止细胞碎片杂质
中和步骤后，许多质粒制备物需要离心以将 DNA 与细胞碎片分离，从而澄清裂解物。在此步骤中，重要的是要缓慢进行，并避免将不必要的细胞碎片转移到下一步，这可能会干扰结合和/或降低纯度。
记得添加酒精
许多质粒制备试剂盒包含使用乙醇的洗涤缓冲液。这些缓冲液通常为浓缩液，使用前必须用乙醇稀释。这是一个常见的错误，经常被遗忘并导致准备失败。另外，不要忘记确保拧紧盖子以防止乙醇蒸发。
P2加热缓冲液
下游转化问题的一个常见原因是盐和蛋白质的污染。确保每次纯化后测量A 260/A280和A260/A230比率，高于1.8的比率通常被认为是纯净且不含污染物的。
不要一次处理太多样品
虽然可以最大限度地提高时间效率，但质粒纯化中的某些步骤对时间敏感。不要尝试一次处理太多样本，否则某些准备工作可能会放置太久而失效。
不要忘记热洗脱
如果质粒>10 kb，请考虑使用加热至50°C的洗脱缓冲液，以提高从柱基质上洗脱的效率。此外，离心前可以将洗脱缓冲液留在柱上5-10分钟。
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胎牛血清在使用过程中的注意事项有哪些？

胎牛血清是一种常用的细胞培养基添加剂，通常用于增强细胞的生长和增殖能力。那么你知道胎牛血清在使用过程中的注意事项有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损

血清解冻时应将血清从-15~-70℃的低温冰箱中取出放入4℃冰箱解冻1天，待全部解冻后再分装。解冻过程中请不时摇匀（小心勿造成气泡），使血清成分和温度均匀，从而减少沉淀的产生。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻，并避免反复冻融。需要长期保存的血清必须储存于-20℃到–70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会被破坏，而影响血清质量。

二、有时在血清中见到的絮状沉淀可能是些什么物质

主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量，可用400 xg离心5 min去除，也可不用处理。

三、如何避免血清中产生沉淀

(1) 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(2) 血清分装冻存时，须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一。

(3) 勿直接由-20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

(4) 勿将血清置于37℃太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成份也会因此受到破坏，从而影响血清的品质。

(5) 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，无须做此步骤。

(6) 若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

四、热灭活对血清的作用是什么

热灭活步骤能够灭活补体系统。补体会参与以下事件中：溶解细胞事件，平滑肌收缩，肥大细胞与血小板释放组胺，吞噬作用增强，趋化作用，淋巴细胞与巨噬细胞的活化等。

五、加到培养基中的血清必须灭活吗

不是必须的，看做什么实验。如果用于培养普通细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。

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免疫荧光实验的步骤有哪些？

免疫荧光（IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项检测技术。可用于检测和识别细胞和组织中蛋白质及其他分子的亚细胞分布和迁移。那么你知道免疫荧光实验的步骤有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、细胞准备

对于单层生长的细胞，将细胞接种到预先处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，用PBS洗涤两次。

对于悬浮生长的细胞，取对数生长的细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm, 5min）两次，然后用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

二、固定

根据需要选择适当的固定剂来固定细胞。

固定完毕后的细胞可置于含有叠氮纳的PBS中，在4℃保存3个月。用PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟。

三、通透

对于使用交联剂（如多聚甲醛）固定的细胞，一般需要在加入抗体之前进行通透处理，以确保抗体能够到达抗原部位。选择通透剂时应充分考虑抗原蛋白的性质。通透时间一般在5-15分钟。通透后用PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟。

四、封闭

使用封闭液对细胞进行封闭处理，时间一般为30分钟。

五、一抗结合

在室温孵育1小时或者在4℃过夜。用PBST洗涤3次，每次冲洗5分钟。

六、二抗结合

对于间接免疫荧光，需要使用二抗。在室温避光孵育1小时。用PBST洗涤3次，每次冲洗5分钟，然后再用蒸馏水洗涤一次。

七、封片及检测

滴加一滴封片剂，然后封片，最后使用荧光显微镜进行检查。

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细胞悬浮培养生物反应器有哪些？

悬浮细胞培养生物反应器是生物工程中一项重要的技术手段，它广泛应用于生物制药、生物燃料以及其他生物工艺过程中。不同类型的悬浮细胞培养生物反应器在培养条件、操作方式以及设计结构上有所不同，充分发挥着各自的优势。那么细胞悬浮培养生物反应器都有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、搅拌罐反应器

搅拌罐反应器是最常见的悬浮细胞培养生物反应器之一。它通过机械搅拌的方式保持培养物中的细胞在悬浮状态，并提供足够的氧气和营养物质供给细胞生长。搅拌罐反应器的结构相对简单，易于操作和维护。但是，搅拌对细胞造成的剪切力和气泡的冲击对细胞生长和产品产量可能产生不利影响。因此，在搅拌罐反应器中需要控制搅拌速度和气体进气量，以平衡培养物的混合与气液质传递过程。

二、气升式反应器

与搅拌罐反应器相比，气升式反应器在气液传质过程中有更好的性能。气升式反应器通过气泡的上升运动来实现气液传质，气泡与液相之间的接触面积大大增加。此外，气升式反应器中气体的上升运动产生的液体流动也有助于悬浮细胞的混合，减小局部液体环境的差异性。因此，气升式反应器能够提供更好的氧气和营养物质供给，同时减少悬浮细胞受到的剪切力。然而，气升式反应器的结构相对复杂，操作和维护的难度较大，需要特殊的气体装置和控制系统。

三、一次性反应器

近年来，一次性反应器的应用逐渐增多，成为一种新兴的悬浮细胞培养生物反应器。一次性反应器由于其相对简单的结构和操作，减少了反应器清洗和消毒的工作量，能够降低交叉感染的风险，并节省生产成本。一次性反应器还具有良好的可扩展性，方便批量生产。然而，一次性反应器在气液传质和控制方面可能存在一些问题，如氧气和营养物质的供给不均一，不易进行pH和温度的调节等。因此，在使用一次性反应器时需要根据具体情况进行改进和优化。

一次性反应器，又被称为一次性使用的生物反应器，是一种非常方便和实用的反应器，广泛应用于悬浮细胞培养和生物工艺过程中。相对于传统的玻璃或不锈钢反应器，一次性反应器具有许多显著的优点，例如简单方便的操作、减少交叉感染风险、节省清洗和消毒时间、降低生产成本等。

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蛋白质含量测定方法有哪些？

蛋白质含量测定实验可以用于测定蛋白质浓度和检测所提取的蛋白质含量，那么蛋白质含量测定方法有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、folin—酚试剂法

这种蛋白质测定法是zui灵敏的方法之一。过去此法是应用zui广泛的一种方法，由于其试剂的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

folin-酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯yi酸（0.5%），乙醇（5%），yi醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

二、考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

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悬浮细胞培养的操作步骤与注意事项有哪些？

悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，那么悬浮细胞培养的操作步骤与注意事项有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、步骤

1. 将准备好的冻存细胞放入37℃水浴中解冻。

2. 用70%乙醇对顶端进行消毒，用吸管将细胞转移到含有5mlwan全MEM-10培养基的25cm2组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，放入5%CO2加湿培养箱中37℃培养过夜。

3. 将培养基吸出，用0.5ml37℃的胰酶/EDTA覆盖细胞，消化30~40s。

4. 加入10ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞转移至50ml的离心管中。室温1800g离心5min，弃上清。

5. 将细胞沉淀悬浮在5ml的旋转瓶wan全培养基-5中，上下吹打，将细胞团打散。

6. 在100ml或200ml通气旋转瓶中加入50ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞悬液转移到瓶中。

7. 取出1ml细胞悬液，用血细胞计数器进行细胞计数。加入适量的旋转瓶wan全培养基-5，使细胞密度为（3~4）×105细胞/ml。将细胞放入无CO2培养箱，37℃旋转培养。

8. 随后的两天让细胞继续生长，并且每天对细胞进行计数，加入适量的旋转瓶wan全培养基-5以维持（3~4）×105细胞/ml的细胞密度。

9. 取1ml的细胞悬液，用血细胞计数器对细胞进行监测。

10. 当细胞密度达到（4~5）×105细胞/ml时，隔天或每天用培养基将细胞稀释至1.5×105或2.5×105细胞/ml。

11. 分别将装有50ml或100ml细胞悬液的100ml或200ml通气旋转瓶放入37℃无CO2培养箱旋转培养。每天或隔天传代。

二、注意事项

由于有些细胞是不能被养活的，所以需要高的初始密度。

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贴壁细胞培养的步骤有哪些？

在动物细胞培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，其依靠自身分泌或培养基中的贴附因子才能在该表面生长增殖的离体动物的培养细胞。那么贴壁细胞培养的步骤有那些呢？让我们一起来看看吧！

1. 将含有冻存细胞的安瓿放入37℃水浴中解冻。

2. 用70%乙醇对安瓿的顶端进行消毒，打开安瓿，用吸管将细胞转移到含有5ml起始培养基的25cm2组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，将其放入5%CO2加湿培养箱中37℃培养过夜。

3. 吸出起始培养基，换成适当的维持培养基。将细胞放回CO2培养箱37℃培养，每天检查细胞是否生长至汇片。

4. 如果细胞生长至汇片，吸出培养基。

5. 用PBS或胰酶/EDTA清洗细胞，除去细胞上残留的血清，将洗液吸出。

6. 用37℃、适当体积的胰酶/EDTA刚好覆盖单层细胞（如对于25cm2培养瓶需要0.3ml）。消化30～40s（细胞应该分开），晃动培养瓶使细胞wan全分开。

7. 加入1.4ml适当的维持培养基，用吸管来回吹打细胞悬液多次以打散细胞团（这些细胞用于传代）。

8. 吸出0.5mL的细胞悬液，将其加入到新的含有30ml维持培养基的组织培养瓶中。轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，将其放入CO2培养箱中37℃培养直到细胞生长至汇片（大约1周）。大约间隔一周用维持培养基进行1:20稀释传代以维持细胞生长。

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质粒构建实验影响因素有哪些？

质粒构建是指选定的目的外源基因（DNA）先要经过PCR扩增。随后用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA片段，再使用DNA连接酶将切割后的载体与DNA片段连接，转入宿主细胞。最后经过筛选鉴定出正确的重组克隆质粒，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。那么质粒构建实验影响因素有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、载体的选择

在选择克隆载体时应注意以下几点：

①具有自主复制能力，拷贝数高；

②携带易于筛选的选择标记；

③含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入；

④载体应尽可能小（＜15kb），便于导入细胞和进行繁殖；

⑤使用安全。克隆载体应只存在于有限范围的宿主内，在宿主体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。

二、引物设计注意事项

在构建质粒时，设计引物时应该考虑引物长度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素，并避免引物间出现配对突变或二次结构等情况。

前向引物：5’端 — 上游克隆载体末端同源序列 + 基因正向扩增引物 –3’端

反向引物：3’端 — 基因反向扩增引物 + 下游克隆载体末端同源序列 –5’端

运用PCR扩增目的基因的过程中，引物设计注意事项：

① 引物长度最好在18-30bp左右，常用的长度是 20-22bp；

②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，相差最好不要超过 5°C；

③GC 的含量标准通常为 40%-60% 或45-55%；

④引物自身不应含有连续超过4个的互补的碱基，避免形成发卡结构或形成引物二聚体；

⑤引物的3’端要避免出现连续重复的碱基，如 GGG 或 CCC ，这会导致错配的发生，最后一个碱基最好是 G 或 C；

⑥在引物的 5’端添加酶切位点时（在不影响扩增的特异性的前提下），根据酶切位点序列，需要添加不同种类和数量的保护碱基，通常多加3个碱基即可满足保护酶切位点的需求；

⑦上下游引物最好加入不同的酶切位点，相同的酶切位点可能导致目的基因片段出现倒置连接现象，影响基因序列的正常表达。

三、酶切位点的选择

选择合适的剪切酶和连接酶对于质粒构建至关重要。剪切酶的选择应该考虑酶切位点的位置、酶的反应条件等因素。连接酶的选择应该根据所用的质粒载体和目的基因的大小来确定。

①选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。

②一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：

目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）。

③实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。

④尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。

⑤两个酶切点至少隔上3个碱基。

⑥两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

⑦最好使用酶切效率高的酶。

⑧最好使用双酶切有共同buffer的酶。

⑨在操作酶切连接的步骤时也要定性定量，保证酶活性充足。

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