稳定同位素标记的高维度代谢组学用于识别植物中缺失的特征代谢

稳定同位素标记的高维度代谢组学用于识别植物中缺失的特征代谢

    特征代谢的确切机制及其在植物进化中的重要性仍然是个谜。特征代谢的产物及其相应的生物合成基因对于理解某些代谢普遍存在的原因至关重要。尽管基于质谱(MS)的代谢组学使我们能够获得未知特征代谢物、已知代谢物及其对应异构体或类似物的结构特征数据,但分析方法的拓展仍然十分必要。在此,回顾总结了使用稳定同位素标记识别未知特征代谢物的先进分析方法。

    迄今,地球上大约391000种维管植物中的225种基因组已被测序。由于测序及数据分析技术方法的进步,预计这一数字在不久的将来会迅速增加。现代基因组测序能做到一个物种的全基因组分析或染色体规模的基因组分析。这些方法可用于从测得的基因组中获得相关代谢类型的详细信息。

   植物有两种代谢类型,即初级代谢,次级代谢或特殊代谢。初级代谢对于维持植物的生存十分必要,其与包括氨基酸、糖、脂肪酸和脂类在内的代谢物息息相关,且在进化早期即形成,存在于所有已知的植物中。而植物进化出特殊代谢的原因尚不明确;过去十年的研究表明,特殊代谢产物能保护植物抵抗环境胁迫,包括生物和非生物胁迫。为了确定特殊代谢物的作用,对相关生物合成基因修饰或缺失导致缺乏此类特殊代谢物的植物进行比较分析是必不可少的。例如,通过对比野生型和突变体的类黄酮生物合成途径,能阐明代谢物对氧化和干旱相关胁迫的作用。各种野生型物种的比较遗传分析揭示了酰化类黄酮对紫外线-B具有缓解作用,表明当植物暴露在严重的胁迫下时,它们会过度产生特殊的代谢物,表现出一定的缓解胁迫的能力。

     已有研究表明,参与代谢的剩余基因仍然存在于基因组中;然而,由于对应代谢物未被识别,对应基因的功能因此也未能被确认。因此,要确定相应基因的功能,必须揭示相应的代谢物。每一种植物有自己的“特殊代谢组”,其由特殊代谢物组成。植物界中至少有391000个这样的特殊代谢组。我们应该发展分析方法去识别尽可能多的特殊代谢组。MS是获取全面代谢组学数据的有力工具。串联质谱(MS/MS)图提供了有关代谢产物的结构信息,包括正负离子模式下m/z值和同位素分布信息。在液相色谱(LC)中,代谢产物的化学性质会影响其保留时间;例如,使用普通反相柱进行LC分析时,高极性代谢物保留时间较短,而非极性代谢物保留时间较长,其表明在对代谢物进行归属时,尽可能多地考虑到各个数据非常重要。

     根据代谢组学标准倡议,代谢物的化学归属分为四个级别:1级:鉴定;2级:注释;3级:表征;4级:未知;数据分析方法依此进行。现有的方法在鉴定“未知”代谢物方面依然存在困难。基于MS的代谢组学当前的挑战之一是开发归属未知代谢物的方法。核磁共振(NMR)能够成功地进行结构鉴定,是因为NMR提供了代谢物的多面或多维谱;而在基于MS的代谢组学中,LC-MS/MS采集的质谱图也能提供有用的代谢物结构信息。

在此,回顾了LC-MS/MS分析中使用稳定同位素标记测定未知代谢物的先新方法。这类方法中,使用稳定同位素标记的原子会导致目标化合物离子m/z值的偏移。这种偏移有助于确定化合物包含的原子数以及其他特性。

一、将结构异构体或类似物化学归属为“表征”

1级“鉴定”层次中,样品中检测到的化合物的LC-MS/MS特征被与真实标准化合物(包括分离代谢物或合成产物)的LC-MS/MS特征进行匹配。在基于MS的代谢组学中,将样品与标准品共洗脱是准确的化学归属方法。由于可得的标准品有限,研究人员也会使用共享数据库中的LC-MS/MS数据或MS/MS数据进行研究。在2级“注释”层次中,样品中采集到的MS/MS谱被与数据库谱图进行比较。然而,由于特殊代谢物的化学多样性,即使使用了标准化合物和数据库比对,鉴定和注释所覆盖的代谢物也仅仅少于5%。在3级“表征”层次中,通过对化合物MS/MS特征解析,以推测代谢物或代谢物含有的官能团。比如,植物通过生物反应会产生结构异构体和类似物,同分异构体中具有相同骨架和官能团的部分会得到相似的MS/MS图,而类似物结构中修饰部分的质谱图会稍显不同。需要注意的是,这些异构体和类似物结构类似,但通常具有明显不同的生物学功能。他们的MS/MS谱的相似处可用于分析检测到的代谢物异构体和类似物之间的关联(图1)。利用这种相似性能有效发现新的结构异构体/类似物,在已有研究中能增加约40%化合物化学归属。

稳定同位素标记的高维度代谢组学用于识别植物中缺失的特征代谢

1 表征化学归属结构异构体/类似物

未知代谢物亟需更深入的研究方法

“表征”方法的发展使挖掘更多的结构异构体/特殊代谢物的类似物成为可能。对于鉴定目标代谢物的未知异构体/类似物的研究人员来说,比对MS/MS的相似性是一个重要的步骤。一旦核心代谢物的MS/MS被更新到共享数据库中,其未知的异构体/类似物可能通过MS/MS的相似性与其产生关联。在植物界,可能还有特殊代谢物具有未被揭示的骨架结构。为了促进这类代谢物的归属,亟待更深入的方法。要做的即是开发用于从代谢组数据中排除已鉴定、注释和表征的代谢物的方法。

稳定同位素标记谱图可作为另一维数据

准确的质量分析是确定分子式的关键。目前,质谱仪准确度有了显著提高,使得质量准确度可达0.1mDa;但是要确定未知代谢物的分子式,仅靠准确度是不够的。在m/z不超过1500的小分子中,至少会有几个候选分子式。在超高分辨率分析中,精确分子量和同位素峰簇同时被用于确定分子式。在中分辨分析(如使用四极杆飞行时间质谱)中,同位素峰簇因为没有被分离而难以被利用。这些事实表明,在中分辨分析中还需要其他的定性条件。

稳定同位素标记被用于阐明生物化学和天然产物化学中的结构。生物体可以从含有稳定同位素标记的中间体获得部分或全部标记的代谢物。NMR分析对比标记代谢物的谱图和非标记代谢物的谱图可以准确地进行结构解析。例如,在13C NMR中,非标记代谢物的化学位移和13C标记代谢物的耦合常数代表碳链的连接方式。

由于稳定同位素对生物体内特定代谢物的产生没有显著影响,同位素标记可应用于基于MS的植物代谢组学。例如,13CO2被广泛用来标记植物,然后比较未标记和标记的质谱图,以确定m/z值的变化(图2)。根据一级或MS/MS的分析结果计算确定每个原子的数量。利用得到的原子数,结合质量精度和同位素峰簇,可以从一系列可能的候选分子中归属得到代谢物的分子式。对于拟南芥样品,使用13C15N34S标记得到的代谢物的质谱图分析,可以明确代谢物的分子式。

稳定同位素标记的高维度代谢组学用于识别植物中缺失的特征代谢

2 使用LCMS/MS和稳定同位素标记的代谢组学示例。

来源:本文来源网络,版权归相关权利人所有,如侵权,请联系删除

稳定同位素示踪技术在氨基酸代谢调控中的应用

稳定同位素示踪技术在氨基酸代谢调控中的应用

氨基酸在合成代谢和分解代谢中起着关键作用,它们不仅是蛋白质的组成部分,而且是许多关键代谢产物的前体,并被氧化以提供能量。氨基酸在体内的代谢包括4个方面(图2):

转化为非蛋白的含氮化合物,如嘌呤、嘧啶、胆碱等;

通过脱氨基作用转化为NH3α-酮酸,α-酮酸终转变成糖类、酮体或经过TCA氧化成二氧化碳和水,并放出能量;

通过脱羧作用依次转化为胺、醛、酸,终生成二氧化碳和水;

过剩氨基酸将通过排泄方式排出体外。在氨基酸代谢调控研究中,稳定同位素示踪技术多用于研究氨基酸的合成与转化,通过对特定氨基酸进行同位素标记,根据标记原子追踪该氨基酸的代谢路径,精确了解氨基酸的代谢情况,进而研究其在机体内的重要功能。


稳定同位素示踪技术在氨基酸代谢调控中的应用

研究了冬虫夏草中茶氨酸的积累多于其他植物的机制,比较了冬虫夏草与其他植物(如金花茶、山茶花、玉米、拟南芥和番茄)中茶氨酸的含量,并用稳定同位素示踪技术阐明其生物合成途径。通过质谱法对相关中间体和代谢物进行定量分析发现,补给2N5-乙胺后,所有植物均产生2N5-茶氨酸,这就暗示乙胺的可用性将是茶氨酸在冬虫夏草和其他植物中积累差异的原因。


前期发现啮齿目动物膳食必需氨基酸(NEAAs)作为氮源的重要性,且每个必需氨基酸均具有不同的促生长活力。他们对必需氨基酸进行同位素标记(15N,比较膳食中必需氨基酸氮素代谢的差异,借助氨基酸分析仪和串联质谱分别测定肠道及血浆中氨基酸的浓度和相应的15N丰度。终揭示了大鼠肠道中必需氨基酸氮代谢的异同,暗示膳食中必需氨基酸的氮素主要通过肠内代谢大量进入氨基酸氮循环。


通过描述载脂蛋白M与脂代谢其他成分间的相互作用来更好地明确其在动脉粥样硬化中的潜在优势。给14名男性受试者持续注入14 h 2H3-亮氨酸,每小时取1次血样并用液相色谱串联质谱进行分析,脂蛋白中的部分分解速率和产率采用房室模型进行计算。结果表明,低密度脂蛋白动力学在载脂蛋白M周转过程中发挥关键作用,血浆三酰甘油对载脂蛋白M1-磷酸鞘氨醇在脂蛋白间的分布均起作用,进一步证实了载脂蛋白M分泌后可被结合到高密度脂蛋白中,然后与非脂蛋白相关的室进行快速交换,也可被结合到低密度脂蛋白被慢慢分解代谢。


此外,CO2呼气法是同位素标记氨基酸用于临床诊断的一种新方法。其原理是给患者口服或静脉注射一定量某种13C标记的氨基酸,根据其身体某部位上发生特定的氧化代谢,产生含13CCO2,经肺呼出后用NaOH吸收,将生成的Na213CO3用酸处理获得13CO2气体,经纯化后,利用13C-呼气试验专用质谱仪来检测13CO2的浓度变化,绘出13CO2排出特征曲线。某种疾病的患者对某种氨基酸的氧化能力与正常人不同,因此,所获得曲线也存在明显的差异,从而可以进行临床诊断。Kirschmhai[46]用实验的方法控制两栖类动物的生理应激,通过呼吸测量法和13C呼气试验检测发展和蜕变过程中能量和营养物质的消耗。研究结果为幼虫生长和发育之间生理平衡的近因提供了证据,并为整个生命阶段能量和营养的消耗提供了新的认识。


稳定同位素标记氨基酸的检测方法快速准确、灵敏度高,现已应用于科学研究的各个领域。采用稳定同位素标记的氨基酸作为示踪剂,可准确把握氨基酸的合成与代谢途径,对揭示其在生物体内的转化规律起到了关键性作用;同时还可追踪蛋白质合成与代谢过程,利用患病状况下蛋白质合成的异常来诊断疾病。

来源:本文来源网络,版权归相关权利人所有,如侵权,请联系删除

伊莱瑞特细胞功能与代谢检测试剂盒代理商

上海金畔生物科技有限公司是伊莱瑞特细胞功能与代谢检测试剂盒代理商 ,欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
伊莱瑞特细胞功能与代谢检测试剂盒代理

详情介绍

伊莱瑞特细胞功能与代谢检测试剂盒代理——上海金畔生物科技有限公司,提供细胞功能检测试剂盒和细胞代谢检测试剂盒等多种试剂盒,欢迎选购!

伊莱瑞特细胞功能与代谢检测试剂盒代理——上海金畔生物科技有限公司,提供各种用于检测细胞功能的试剂盒,包括细胞凋亡检测、细胞周期检测、细胞增殖/毒性/活力检测,助力您的细胞相关研究。 Elabscience细胞功能检测试剂盒,包含细胞凋亡检测(Annexin V系列、 TUNEL系列、Caspase系列和JC-1)、细胞增殖/毒性/活力检测和细胞周期检测,样本类型丰富,可适配多种检测仪器,您可以根据实验需求及样本类型、仪器型号选择适合的试剂盒。部分伊莱瑞特细胞功能与代谢检测试剂盒产品如下:

产品名称

货号

品牌

One-step Rapid Dewaxing Solution

一步法快速脱蜡液

E-CK-A032

Elabscience

Annexin V-Biotin Reagent

Annexin V-Biotin 染色液

E-CK-A110

Elabscience

Annexin V-Biotin Azide-Free Lyophilized Powder

细胞培养型Annexin V-Biotin冻干粉

E-CK-A110U

Elabscience

Annexin V-FITC Reagent

Annexin V-FITC 染色液

E-CK-A111

Elabscience

Annexin V-FITC Azide-Free Lyophilized Powder

细胞培养型Annexin V-FITC冻干粉

E-CK-A111U

Elabscience

Annexin V-Elab Fluor® 647 Reagent

Annexin V-Elab Fluor® 647 染色液

E-CK-A113

Elabscience

Annexin V-Elab Fluor® 647 Azide-Free Lyophilized Powder

细胞培养型Annexin V-Elab Fluor® 647冻干粉

E-CK-A113U

Elabscience

Annexin V-PE Reagent

Annexin V-PE 染色液

E-CK-A115

Elabscience

Annexin V-APC Reagent

Annexin V-APC 染色液

E-CK-A117

Elabscience


上海金畔生物科技有限公司提供细胞代谢检测一站式方案,提供细胞组分提取试剂,代谢检测试剂盒及抑制剂筛选试剂盒。研究领域涉及铜死亡、三羧酸循环、铁死亡、线粒体系列、代谢疾病、双硫死亡、氧化应激、肝肾功能、氨基酸蛋白、糖脂代谢、无机盐离子、植物生理系列等。广泛应用与药物筛选、癌症、代谢疾病等研究。部分伊莱瑞特细胞代谢检测试剂盒产品如下:

产品名称

货号

品牌

Angiotensin I Converting Enzyme 2 (ACE2) Inhibitor Screening Kit

血管紧张素转化酶2(ACE2)抑制剂筛选测试盒

E-BC-D001

Elabscience

Matrix Metalloproteinase 3 (MMP-3) Inhibitor Screening Kit

基质金属蛋白酶3抑制剂筛选试剂盒

E-BC-D003

Elabscience

Dipeptidyl Peptidase IV (DPP4) Inhibitor Screening Assay Kit

二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂筛选测试盒

E-BC-D007

Elabscience

Hydrogen Peroxide (H2O2) Fluorometric Assay Kit

过氧化氢(H2O2)荧光法测试盒

E-BC-F001

Elabscience

ATP Chemiluminescence Assay Kit

ATP含量化学发光法测试盒

E-BC-F002

Elabscience

Lipid Peroxide (LPO) Fluorometric Assay Kit

脂质过氧化物(LPO)荧光法测试盒

E-BC-F003

Elabscience

Catalase (CAT) Activity Fluorometric Assay Kit

过氧化氢酶(CAT)荧光法测试盒

E-BC-F006

Elabscience

Malondialdehyde (MDA) Fluorometric Assay Kit

丙二醛(MDA)荧光法测试盒

E-BC-F007

Elabscience

Myeloperoxidase (MPO) Peroxidation Activity Fluorometric Assay Kit

髓过氧化物酶(MPO)过氧化活性荧光法测试盒

E-BC-F013

Elabscience

更多有关伊莱瑞特细胞功能与代谢检测试剂盒的产品介绍,请联系上海金畔生物科技有限公司!

药物代谢动力学分析技术服务

药物代谢动力学分析技术服务

药物代谢动力学分析简介
1.了解药物的吸收、分布、生物转化、排泄的基本概念及影响因素。掌握关消除概念及细胞膜两侧pH对药物吸收和分布的影响。
2.熟悉药物消除动力学、时量曲线及多次给药的血药浓度变化
3.掌握药代动力学基本参数的药理学意义。了解房室模型及意义。
药物的吸收和影响因素
药物的吸收(absorption)
吸收是指药物从用药部位进入血循环的过程。口服药物吸收后经门静脉进入肝脏,有些药物进入肝脏就被肝药酶代谢,进入体循环的药量减少,称为关消除(first pass elimination)。经过肝脏关消除过程后,进入体循环的药量与实际给药量的相对量和速度,称生物利用度。药物的吸收分布及排泄过程中的跨膜转运有多种形式,但多数药物是以简单扩散的物理机制转运,扩散速度除取决于膜的性质、面积及膜两侧的浓度梯度外,还与药物的性质有关。分子小、脂溶性大、极性小、非解离型的药物易通过生物膜。药物的解离度也因其pKa(酸**物解离常数的负对数)及所在溶液的pH不同而不同。非解离型(分子态)药物可以自由通过生物膜,离子型(解离型)药物不易通过生物膜。多数药物为弱酸性或弱碱**物。弱酸**物在酸性环境中解离少,分子态多,易通过生物膜;弱碱**物则相反。由于膜两侧pH不同,当分布达平衡时膜两侧的药量会有相当大的差异。
药物的分布和影响因素
药物的分布(distribution )
指药物从血循环系统到达组织器官的过程。影响分布的因素 ① 药物本身的物理化学性质(包括分子大小、脂溶性、pKa等)。② 药物与血浆蛋白结合率:结合药不能通过生物膜,只有游离药物才能向组织分布。③ 组织器官的屏障作用,如血脑屏障、胎盘屏障。④ 细胞膜两侧体液的pH。如细胞内液pH(约为7.0)略低于细胞外液(约7.4)、弱碱**在细胞内浓度略高,弱酸**在细胞外液浓度略高,根据这一原理,弱酸******中毒时,用碳酸氢钠碱化血液和尿液可使脑组织中药物向血浆转移,并减少肾小管的重吸收加速自尿排泄。
药物的代谢
药物的生物转化(biotransformation) 又称代谢,是指药物在体内多种药物代谢酶(尤其肝药酶)作用下,化学结构发生改变的过程。肝脏微粒体的细胞色素P-450酶系统,是肝内促进药物代谢的主要酶系统,简称肝药酶。肝药酶具有活性有限、个体差异大、易受药物的诱导和抑制的特点。某些药物能增加肝药酶的活性,增加药物的生物转化,称肝药酶诱导剂,反之则称肝药酶的抑制剂。
药物的排泄
药物的排泄(excretion)  排泄是药物从体内排出体外的过程。肾脏是药物排泄的主要器官。原形经肾脏排泄的药物在肾小管可被重吸收,使药物作用时间延长。重吸收程度受尿液pH影响,应用酸性药或碱**,改变尿液的pH,可减少肾小管对药物的重吸收。
有些药物如洋地黄毒甙,部分在肝细胞与葡萄糖醛酸结合后,随胆汁排入小肠,在小肠水解后游离药物又被吸收,称肝肠循环(hepato-enteral circulation)。洋地黄毒甙中毒时,可服用消胆胺,消胆胺可与洋地黄毒甙在肠道结合,结合物随粪便排泄,打断肝肠循环。乳汁pH略低于血浆,碱**物部分可自乳汁排泄。从乳汁排泄量较多的药物应注意对乳儿的影响。

 

咨询与订购
感谢您选择我们的服务,如果您有任何问题,请联系我们,我们将竭诚为您解答和服务。