【干货】一文了解vero细胞培养全流程

【干货】一文了解vero细胞培养全流程

Vero细胞系是连续非整倍体细胞,连续细胞系可以经过多次分裂而不衰老,非整倍体是指细胞中的染色体数目与通常的不同。与其它普通哺乳动物细胞不同,Vero细胞还有干扰素分泌缺陷的特点,当被病毒感染时,它不能分泌干扰素,但它仍然具有α/β-干扰素的受体,所以对于其它来源的干扰素仍有正常的反应。

一、基本信息

细胞名称:Vero非洲绿猴肾细胞

细胞别称:VERO; Verda reno

细胞形态:上皮细胞样

生长特性:贴壁生长

组织来源:正常肾

培养基:MEM+10%FBS+1%PS

生长条件:

气相:95%空气+5%二氧化碳;

温度:37℃

传代方法:1:21:3,每周2-3次。

二、培养指南

1. Vero细胞复苏步骤

(1)1mL Vero细胞悬液冻存管于37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基进行混合均匀;

(2)1000rpm条件下离心4min,弃上清液,再加入1-2mL培养基后轻轻吹打混匀;

(3)Vero细胞悬液加入到含有适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入到6cm皿中,加入约4mL的培养基,培养过夜);

(4)第二天换液并观察Vero细胞密度。

2. Vero细胞传代步骤

Vero细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

(1)1mL Vero猴肾细胞悬液冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀;

(2)1000rpm条件下离心4min,弃上清液,再加入1-2mL培养基后吹打混匀;

(3)Vero猴肾细胞胞悬液加入到含适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入到6cm皿中,加入约4mL培养基,培养过夜);

(4)第二天换液并观察Vero细胞密度。

3. Vero细胞冻存步骤

Vero细胞生长状态良好,可进行细胞冻存。以T25瓶为例:

(1)收集Vero细胞及细胞培养液,装入无菌离心管中,于1000rpm条件下离心4min,弃上清液,用PBS清洗一遍,弃掉PBS后进行细胞计数。

(2)根据Vero细胞数量对应加入无血清细胞冻存液,使细胞密度在5×106~1×107/mL之间,轻轻混匀,每支冻存管冻存1mL细胞悬液,注意冻存管上做好标识。

(3)将冻存管放入-80℃冰箱中,24h后转入液氮灌储存。

三、注意事项

1. 培养基不能回收使用

灌液培养基不能再用来培养细胞,请换用按照说明书细胞培养条件新配制的wan全培养基来培养细胞。

2. 细胞到货处理说明

(1)收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好,培养液是否有漏液、浑浊等现象。

(2)观察好细胞状态后,75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置2-4h

(3)收到Vero细胞后第一次传代建议1:2传代,1:2传代是指1T25瓶传2T25瓶或者26cm皿,而不是1T25瓶传210cm皿。

四、常见问题

1. vero细胞培养出现小黑点?

处理方法:在细胞消化离心弃上清后,使用PBS重悬洗涤,在750rpm条件下低速离心4min,重新铺下,然后镜下观察是否干净。

2. vero细胞生长过慢?

(1)更换不同培养基或血清导致

解决方法:分析新培养基与原培养基的成分,比较新血清与原血清支持细胞生长实验,让细胞逐渐适应新培养基。

(2)有少量细菌或真菌污染

解决方法:用含抗生素培养液培养,如发现污染,尽量丢弃培养物。

(3)试剂保存不当导致

解决方法:血清需要保存在-10-20℃

培养基需在2-8℃避光保存;

含血清wan全培养液在2-8℃保存。

(4)接种细胞起始浓度太低

解决方法:增加接种细胞起始浓度。

(5)细胞已老化

解决方法:引入新的保种细胞,重新培养。

(6)支原体污染

解决方法:吸取部分培养基,离心得上清,检测支原体;

清洁支架和培养箱;

可在培养皿里加入支原体去除剂清除;

如发现支原体污染,建议尽量丢弃。

3. vero细胞培养过程中不贴壁?

(1)胰酶消化过度导致

解决方法:尝试缩短胰酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。

(2)支原体污染

解决方法:吸取培养2-3的培养基,检测支原体;

清洁支架和培养箱;

 如发现支原体污染,丢弃培养物。

(3)培养基pH值过碱(NaHCO3分解)

解决方法:使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2

(4)细胞老化

解决方法:购买新的代数较低的细胞。

(5)接种细胞起始浓度太低或太高

解决方法:调节最佳接种细胞浓度。

4. vero细胞用什么培养基?

vero细胞培养基:MEM+10%FBS+1%P/S

5. vero细胞DMSO冻存比例?

冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配或无血清细胞冻存液。

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