由于合成方法成本高，产量低，发酵方法难以分离目标活性肽。蛋白质酶水解常用。然而，除肽外，其产物还含有一些未水解的蛋白质。氨基酸。蛋白酶等。为了获得目标活性肽，还需要更深层次的分离和纯化。
目前，多肽分离和纯化的主要方法有超滤、盐分析、凝胶、离子交换分析、色谱法、电泳法等。这些方法是基于氨基酸和多肽。多肽与蛋白质的分离和纯化。根据不同的需要，几种方法通常用于实际应用。常用的分离和纯化方法如下：
(1)超滤：
超滤是根据超滤膜孔径的大小分离处理样品的分子量和形状。超滤是膜分离法中最常用的分离和纯化多肽的方法。在处理多肽样品的过程中，酶解过程应与超滤分离过程相连，并根据处理样品的特点选择合适的膜材料，以实现产品分子量的控制。超滤法在操作过程中需要消耗大量的水，因此后期的浓度会消耗时间，如果初始液体预处理不当，会导致膜孔堵塞，影响膜的使用寿命，成本相对昂贵。
(2)盐析:
高浓度的中性盐可以使溶液中的大分子物质积累形成沉淀，这个过程是盐分析。蛋白质和肽的特征基团，如NH2.-OH.-COOH，是亲水基团，可与水形成水化层，然后与蛋白质分子形成亲水胶体，降低蛋白质分子之间的力，从而增加蛋白质和肽的溶解度。在蛋白酶溶液中加入大量高浓度的中性盐，中性盐会带走大量的水分子，破坏膜结构，疏水基团暴露，电荷中和，亲水胶体破坏，然后蛋白质和肽积累沉淀，获得目标肽。虽然盐分析方法操作简单。成本低，但在这个过程中不可避免地会增加肽的含量，影响肽的味道。
(3)纳滤:
纳滤膜是一种分离性能介于反渗透膜和超滤膜之间的方法。纳滤膜具有纳米孔径，截留分子量为100~1000D，而小分子多肽和氨基酸的相对分子量为100~1000D。它们都是性电解质。分子中含有酸性基团和碱性基团。当溶液的pH等于其等电点时，分子为电中性，净电荷为零;当pH偏离等电点时，分子成为带正电荷或负电荷的离子，因此通过空间位阻和电荷效应的共同作用，纳滤膜可以分离溶液中的多肽和氨基酸。采用纳滤技术分离纯化多肽和氨基酸主要基于道南(Donnhai)效应和空间位阻效应。纳滤膜的分离选择性由纳滤膜两种效应共同决定，其中Donhai效应受溶液pH、离子强度和组成以及多肽的影响。氨基酸浓度和膜表面电性应受到严格控制。目前，采用过滤分离技术对氨基酸和肽进行分离纯化的研究取得了许多成果。由于肽和氨基酸混合溶液的复杂性和膜制品的单一性，大部分还没有进入实际应用，大部分都处于实验室研究阶段。
(4)凝胶过滤色谱:
凝胶过滤色谱，又称分子阻力色谱。分子筛分析等，凝胶过滤色谱法是以多孔凝胶填料为固定阶段，利用多肽分子的大小。性质差异达到分离纯化的目的。凝胶过滤色谱的原理是根据分子的大小进行分离。当分离成分进入分析柱时，大分子成分不能进入凝胶颗粒，只能从凝胶颗粒的间隙中随洗液流动，洗涤速度快;小分子成分可直接进入凝胶颗粒，在凝胶颗粒与凝胶间隙之间随洗液流动，洗涤速度慢。因此，根据分析柱内的不同移动速度，大分子成分首先被洗掉，小分子随后被洗掉，以达到分离纯化的目的。在蛋白质、肽和氨基酸的分离和纯化中，应根据分子的大小确定具有足够分离范围的介质，并选择合适的凝胶颗粒。目前，凝胶过滤色谱法已被广泛应用于蛋白质的分离和纯化。它分离方便。
(5)离子交换分析：
离子交换层析是一种利用固定相与分离成分之间的离子交换来分离和纯化物质的方法。离子交换层析法可分为阳离子交换和阴离子交换。在进行离子交换层析时，应注意交换介质的选择。缓冲系统的选择。溶液制备等多种影响因素。目前，离子交换层析法具有重复性好、操作简单、洗涤范围广等优点，更适合工业生产。
(6)高效液相色谱分析方法:
与其他分离方法相比，高效液相色谱分析方法具有更高的准确性和优越性。在分离纯化蛋白质和肽的过程中，高效液相色谱分析方法最常用的是反相高效液相色谱。其分离原理是根据固定液体中待分离的组分的不同分离性能，该方法适用于分离纯化分子量小于5000D的组分，特别是分子量小于1000D的小分子肽。高效液相色谱分析方法具有分离纯化肽的良好效果。检测灵敏度高。分离纯化速度快，更适合分离纯化高纯度肽产品。