Elabscience Caspase 1活性检测试剂盒怎么用？

Elabscience®自主研发的 Caspase 1 Activity Assay Kit 采用分光光度法，可用于检测细胞、组织裂解液或其它样本的caspase 1 活性。那么你知道Elabscience Caspase 1活性检测试剂盒该怎么用吗？让我们一起来看看吧！

一、准备工作

1. Cell Lysis Buffer 溶解后混匀，冰浴备用。

2. 2×Reaction Buffer 溶解后混匀，冰浴备用。

3. Ac-YVAD-pNA 和 pNA 溶解后混匀，冰浴备用。

二、样本准备

1. 细胞样本

按照常规方法收集细胞沉淀，PBS 重悬细胞并计数，600×g离心 5 min，弃上清，按照每 100 万细胞加入 100 μL Cell Lysis Buffer 的比例加入预冷的 Cell Lysis Buffer 重悬细胞，在冰浴条件下裂解 30 min，裂解期间需涡旋震荡 3~4 次，每次 10 s。裂解后的样本，于 4°C，11000 ×g 离心 10~15 min，小心地吸取上清至新的 EP 管中，并置于冰上待用。同时使用 Bradford 法（E-BC-K168-M）测定蛋白浓度。

2. 组织样本

取50 mg待测组织样本，用PBS或者生理盐水清洗1-2次，去除组织中残留的血细胞，用手术剪剪碎，加入200μL 预冷的Cell Lysis Buffer，进行匀浆（在冰浴条件下进行，若组织质量加倍时，加入的预冷Cell Lysis Buffer 也需加倍）。将匀浆好的样本转移至1.5 mL离心管中，冰浴裂解30min。裂解后的样本，于 4°C，11000×g离心10~15min，小心地吸取上清至新的EP管中，并置于冰上待用。同时使用 Bradford法（E-BC-K168-M）测定蛋白浓度。

三、实验步骤

1. 制备 pNA 标准曲线（选做）

1) 配制标准品稀释液：取冰浴的 Cell Lysis Buffer 和2×Reaction Buffer，按照 1:1 配制标准品稀释液，涡旋或吹打混匀。

2) 进行倍比稀释：取6支EP管，第一支EP管中加入294 μL标准品稀释液，其他每管中加入150 μL标准品稀释液，从pNA (10 mM)的标准品中吸取6 μL到第一支 EP管中混匀配成 200 µM 的标准品工作液，吸取150 μL 到第2支EP管，混匀后吸取150 μL到第3支EP管，按此步骤往后依次吸取混匀至第5支EP管，如下图所示：

3) 每管取100 µL不同浓度的标准品置于酶标板或比色皿中，检测405 nm下 OD值。（为保证实验结果的准确性，建议所有的待测样本和标准品都设立复孔。）

4) 绘制标准曲线：分别以标准品浓度和对应绝对OD值（每一个标准品的 OD405减去不含pNA的OD405）作为x轴和y轴，使用图形软件绘制标准曲线，如下图所示。实测数据可能因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

2. Caspase 1 的活性检测

1) 取 50 μL 样本裂解液，按照下表设置反应体系。

2) 加入 Ac-YVAD-pNA 后混匀，37°C 孵育 1~2 h，发现颜色变化较明显时即可检测 OD405。若颜色变化不明显，可适当延长孵育时间到 4 h。

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