WB实验常见问题有哪些?如何解决?
Western Blot虽是实验室zui常用的蛋白分析技术,但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多,所以导致在实验过程中会遇到各式各样的问题,那么你知道WB实验常见问题有哪些呢?该如何解决呢?让我们一起来看看吧!
一、目标条带没有信号
原因分析:
1.样品中可能含有蛋白酶,使蛋白样品分解成小分子。
2.目标蛋白浓度过低(低于检测下线)。
3.转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上,或者转膜时间过长导致样品转穿。
4.一抗的特异性不佳,导致一抗无法识别目标蛋白。
解决方法:
1.添加蛋白酶抑制剂。
2.加大上样量或提高目标蛋白浓度。
3.控制转膜时间并选择适合的转印膜。
4.选用高品质抗体。
二、图片背景过高,难以分辨条带
原因分析:
1.一抗浓度太高,导致抗体非特异性结合。
2.洗膜的时间和次数不够,导致其他蛋白没有清洗干净
3.封闭物用量不足。
4.封闭物使用不当。
解决方法:
1.降低一抗浓度。
2.提高洗脱时间和频率。
3.提高封闭物浓度,孵育时保证封闭液wan全浸没转印膜。
4.检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。
三、 膜上出现黑点和黑斑
原因分析:
1.抗体与封闭试剂反应。
2.HRP偶联二 抗中有聚集体。
解决方法:
1.使用前过滤封闭试剂。
2.过滤二抗试剂,去除聚集体。
四、出现非特异性条带
原因分析:
1.一抗非特异性与蛋白结合,此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。
2.目的蛋白有多个修饰位点,有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。
3.蛋白样品降解,蛋白酶将目标蛋白分解成若千个蛋白,而这些蛋白同样可以被一抗识别。
解决方法:
1.更换一抗。
2.更换一抗品种。
3.添加蛋白酶抑制剂。
五、条带粘连
条带粘连是不同孔目标条带连在一起,中间无间隔,如图所示。出现该现象的原因可能是上样量太多,或者是制胶问题,分离胶和浓缩胶之间有间隙,样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。其次是样品弥散(比如电泳长时间停止样品弥散)
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