WB实验常见问题有哪些？如何解决？

Western Blot虽是实验室zui常用的蛋白分析技术，但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多，所以导致在实验过程中会遇到各式各样的问题，那么你知道WB实验常见问题有哪些呢？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、目标条带没有信号

原因分析：

1.样品中可能含有蛋白酶，使蛋白样品分解成小分子。

2.目标蛋白浓度过低（低于检测下线）。

3.转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿。

4.一抗的特异性不佳，导致一抗无法识别目标蛋白。

解决方法：

1.添加蛋白酶抑制剂。

2.加大上样量或提高目标蛋白浓度。

3.控制转膜时间并选择适合的转印膜。

4.选用高品质抗体。

二、图片背景过高，难以分辨条带

原因分析：

1.一抗浓度太高，导致抗体非特异性结合。

2.洗膜的时间和次数不够，导致其他蛋白没有清洗干净

3.封闭物用量不足。

4.封闭物使用不当。

解决方法：

1.降低一抗浓度。

2.提高洗脱时间和频率。

3.提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液wan全浸没转印膜。

4.检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。

三、 膜上出现黑点和黑斑

原因分析：

1.抗体与封闭试剂反应。

2.HRP偶联二 抗中有聚集体。

解决方法：

1.使用前过滤封闭试剂。

2.过滤二抗试剂，去除聚集体。

四、出现非特异性条带

原因分析：

1.一抗非特异性与蛋白结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。

2.目的蛋白有多个修饰位点，有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。

3.蛋白样品降解，蛋白酶将目标蛋白分解成若千个蛋白，而这些蛋白同样可以被一抗识别。

解决方法：

1.更换一抗。

2.更换一抗品种。

3.添加蛋白酶抑制剂。

五、条带粘连

条带粘连是不同孔目标条带连在一起，中间无间隔，如图所示。出现该现象的原因可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）

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