你知道PCR引物设计原则是什么吗？

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。PCR中通常需要两种引物。一种与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补， 另—种与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键，因此，PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。那么PCR引物设计的原则有哪些呢？让我们一起来看看吧！

引物设计的目的是在两个目标之间取得平衡：扩增特异性和效率。因此，引物的设计需要遵循以下原则

一、引物长度要适宜

一般，引物的长度为15-23bp，常用的长度为18-21bp。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应。过短则特异性差。

二、引物GC含量要适宜

1.引物3'端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高， 而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。

2.3'端防止连续三个C或G，引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。

3.上下游引物的GC含量不能相差太大。

三、引物自身及引物之间不应存在互补序列

碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。

四、引物5'端可以修饰，3'端不可修饰

1引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

2引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。

3在引物的5`端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。

五、退火温度要适宜

退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。

原因：如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。

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