NEB T4 DNA连接酶使用说明书

NEB T4 DNA连接酶protocol:

1、在微型离心管(冰上)中设置以下反应：

（T4 DNA连接酶应最后添加。注意：表中显示了使用1mol:3mol插入zhi定DNA大小的载体的连接。）

**注意：T4 DNA连接酶缓冲液应在室温下解冻并重悬。

2、通过吸管上下轻轻混合反应物，并短暂地进行微量离心。

3、对于粘性（粘性）末端，在16°C下孵育过夜或室温下孵育10分钟。

4、对于钝端或单碱基悬突，在16°C下孵育过夜或室温下孵育2小时（或者，高浓度T4 DNA连接酶可用于10分钟的连接）。

5、在65°C下加热灭活10分钟。

6、在冰上冷却，将1-5μl的反应转化为50μl的感受态细胞。

NEB T4 DNA连接酶使用时的注意事项：

1、ATP 是反应中必不ke少的辅因子。这与需要 NAD 作为辅因子的 E. coli DNA 连接酶不同。

2、若需稀释 T4 DNA 连接酶，推荐使用含 50% 甘油的贮存缓冲液（稀释缓冲液 A，NEB #B8001S）稀释，然后于 -20℃ 贮存。如稀释后立即使用，也可以使用 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液稀释。

3、连接反应可以在添加 1 mM ATP 的四种限制性内切酶缓冲液的任何一种或在 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）缓冲液中进行。

4、室温连接。

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