RNA提取试剂盒是如何进行提取的呢?
RNA提取试剂盒用于从细胞、组织、新鲜血液和病毒中提取200bp及以下的smallRNA,用LB10裂解样品后,加入氯仿,溶液分为无色水相和粉红色有机相,RNA在水相中;用RNA硅胶膜离心柱特异地吸附水相中的大分子量RNA(28SrRNA,18SrRNA,mRNA),流出液中的smallRNA用miRNA硅胶膜离心柱特异地吸附。与其它miRNA提取方法相比,该试剂盒裂解能力强、提取量高、专一性强,应用范围广。
RNA提取试剂盒的提取步骤:
1、将处理后的样品在室温静置5~10分钟,使得核酸蛋白复合物*分离。
2、可选步骤:在4°C12,000rpm离心10分钟,取上清转入一个新的RNasefree的离心管中。(当样品富含蛋白质、脂肪、多糖或是细胞外物质例如肌肉、脂肪组织或植物的块茎部分时可能需要额外的分离步骤。)
3、每1ml裂解液RL加200μl氯仿。盖紧样品管盖,剧烈振荡15秒并将其在室温下静置3分钟。
4、4°C12,000rpm离心10分钟,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上清水相层,RNA存在于上清水相层中。
5、将上清水相转入新的离心管中,加入0.5倍上清水相体积的无水乙醇,立即吹打混匀。(不要吸取、沉淀物和漂浮物。漂浮物可能会黏附在枪头的外壁,注意不能将其带入离心管中。)
6、将混合溶液(每次小于700μl,)转入套有吸附柱AC的离心管中,12,000rpm离心45秒,弃掉废液。
7、加500μl去蛋白液RE,12,000rpm离心45秒,弃掉废液。
8、加500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心45秒,弃掉废液。
9、重复步骤8一次。
10、将吸附柱RA放回收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11、取出吸附柱RA(避免吸附柱RA的底部碰到收集管里面的废液),放入新的RNase-free离心管中,在吸附膜的中间部位加50~80μlRNase-freeH2O,室温静置2分钟,12,000rpm离心1分钟。洗脱后的RNA可立即使用或保存在-80°C。