细胞转染的一些事儿

转染前准备：

材料：293T细胞（其他的细胞系种类）、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（TransFast）

器材：20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头、酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD

1、细胞传代培养：取出细胞群，去除培养基，使用PBS清洗2次。

用Tip头加入1ml Trypsin液（胰蛋白酶），消化1分钟（37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞*从壁上脱落下来为止。

加入1ml的含血清培养基终止反应。

用Tip头多次吹吸，使细胞*分散开。

将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞放入一个35mm培养皿。

将合适体积*培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染（当细胞密度达到50-80%时，可用于细胞转染）。

转染过程：

1）转染试剂的准备

A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。

2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

3）将混合液在室温放置10—15分钟。

4）吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

5）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

6）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入*培养基继续培养24－48小时。

第二次细胞传代

1）在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2）再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新放入培养皿中。

3）在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

筛选转染细胞：

1．确定抗生素作用的理想浓度：

不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的作用浓度。

1) 提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细胞，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2 孵箱中37℃培养过夜。

2) 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000μg/ml）。

3) 培养10-14 天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为400-800μg/ml,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半。最终得到和合适的抗生素浓度。

2．转染按前面的步骤进行。

3．转染72 小时后按1:10 的比例将转染细胞在6 孔板中传代，换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在6 孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。

1) 滤纸片法：用消毒的5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15 秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于24 孔板中继续加压培养。细胞在24 孔板中长满后转入25cm 培养瓶中,长满后再转入75cm 培养瓶中培养。

2) 有限稀释法：将细胞通过酶消化下来后做连续的10 倍稀释（10^-2—10^-10），将每一稀释度的细胞滴加到96 孔板中培养，7-10 天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。

4. ELISA 或Western blot 检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。