为了在体内温和的条件下共同修饰蛋白质，必须使用活化剂进行活化。
常用的PEG活化方法包括：
(1)二咪唑法:该方法最早用于多肽合成，被证明是形成酰胺键的好试剂。
(2)N-羟基琥珀酰亚胺法:(a)N、N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化，这种反应也需要在无水条件下进行。(B)琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺活化。该方法活化的聚乙二醇活性较高。最好偶尔在非水环境中连接蛋白质。
(3)氰脲酰氯法：氰脲酰氯，又称三氯化嗪(TST)，是一种对称的杂环化合物。只有一个氯原子被TST和聚乙二醇上的羟基反应所取代，其他氯原子与蛋白质氨基反应。
(4)光气参与活化方法：Kurfuerst在其专利中提到了一些方法，即用N-羟基琥珀酰亚胺钾盐、硝基苯酚、三氯苯酚和光气反应制备活化聚乙二醇。活化主要分为两个步骤，如下图所示。
(5)聚乙二醇对蛋白质半胱氨酸残基的化学修饰，以谷氨酰胺酶(G-TGase)为例。除了传统的化学修饰方法外，还可以通过酶催化来修饰，以谷氨酰胺酶(G-TGase)为例。
最后，选择合适的蛋白质氨基酸残留点或小分子药物点进行定点修改。用活性PEG修改合适的蛋白质氨基酸残留基，提高天然蛋白质的疗效。