四正柏凋亡检测试剂盒说明书
四正柏凋亡检测试剂盒说明书
相关介绍:细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性,对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独te的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以采用Annexin V与PI双染的方法,通过流式检测细胞早期凋亡。
储存条件:2-8℃避光保存,勿冰冻。
有 效 期:一年
注意事项:本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。此产品仅供研究,不用于临床诊断。
操作步骤:
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细胞样品的准备:
a)对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞,至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完quan离心至离心管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。
b)对于悬浮细胞:1000rpm左右离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完quan离心至离心管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。
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用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4x结合缓冲液+12ml去离子水);
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用1x结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为1-5×106/ml;
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取100µl的细胞悬液于5ml流式管中,加入5µl Annexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5分钟;
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加入10µl 20ug/ml的碘化丙锭溶液(PI),并加400µl PBS,立刻进行流式检测。
实验设计:
空白管:阴性对照组细胞,不加Annexin V/FITC,碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压单染管:阳性对照组细胞,只加Annexin V/FITC。用于调节补偿
检测管:处理的细胞,加 Annexin V/FITC,碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿后,获得所需要的流式数据。
样本分析:
1. 流式细胞仪分析:FITC 的最大激发波长是 488nm,最大发射波长是 525nm,建议选择FL1 通道检测;PI-DNA复合物的最大激发波长是 535nm,最大发射波长为 615nm,PI 的红色荧光在 FL2 或 FL3 通道检测。用FlowJo等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),FITC 为横坐标,PI 为纵坐标。典型的实验中,细胞可以分成三个亚群,活细胞仅有很低强度的背景荧光,早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光,晚期凋亡或坏死的细胞有绿色和红色荧光双重染色。
2. 荧光显微镜观察:
a)滴一滴用 Annexin V-FITC/PI 双染的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。
b)在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC 荧光信号呈绿色,PI 荧光信号呈红色。
【注】:对于贴壁细胞,可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。
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